Diferența cheie – Northern vs Southern vs Western Blotting
Detecția unor secvențe specifice de ADN, ARN și proteine este esențială pentru diferite tipuri de studii în biologia moleculară. Electroforeza pe gel este o tehnică care separă ADN-ul, ARN-ul și proteinele în funcție de mărimea lor. Din profilele de gel, o anumită secvență de ADN, secvență de ARN sau proteină sunt detectate prin tehnici speciale numite blotting și hibridizare cu sonde marcate. Există trei tipuri diferite de metode de blotting și anume sud, nord și vest. Diferența cheie între blotting-ul nordic de sud și cel de vest constă în tipul de moleculă pe care o detectează dintr-o probă. Southern blot este o metodă care detectează o secvență specifică de ADN dintr-o probă de ADN. Northern blot este o tehnică care detectează o secvență specifică de ARN dintr-o probă de ARN. Western blot este o metodă care detectează o anumită proteină dintr-o probă de proteine.
Ce este Southern Blotting?
Tehnica South blotting a fost dezvoltată de E. M. Southern în 1975 pentru identificarea unei secvențe specifice de ADN dintr-o probă de ADN. Aceasta este prima tehnică de blotting introdusă în biologia moleculară. Acesta a permis detectarea unor gene specifice din ADN, fragmente specifice din ADN, etc. Există mai mulți pași implicați în tehnica southern blotting. Acestea sunt după cum urmează.
- ADN este izolat din probă și digerat cu endonucleaze de restricție.
- Proba digerată este separată prin electroforeză pe gel de agaroză.
- Fragmentele de ADN din gel sunt denaturate în catene simple prin utilizarea unei soluții alcaline.
- ADN-ul monocatenar este transferat pe o membrană de filtru de nitroceluloză prin transfer capilar.
- ADN-ul transferat este fixat permanent pe membrană.
- ADN-ul fixat pe membrană este hibridizat cu sonde marcate.
- ADN-ul nelegat este spălat de pe membrană prin spălare.
- Filmul cu raze X este expus la membrană și se prepară o autoradiografie.
Southern blotting este aplicat pentru diferite aspecte ale biologiei moleculare. Este util în cartografierea RFLP, studiile criminalistice, metilarea ADN-ului în expresia genelor, detectarea genelor mutante în tulburări genetice, amprentarea ADN-ului etc.
Figura 01: Tehnica Southern Blotting
Ce este Northern Blotting?
Northern blotting este o metodă concepută pentru a detecta o anumită secvență de ARN sau o secvență de ARNm dintr-o probă pentru a studia expresia genei. Această tehnică a fost dezvoltată de Alwine, Kemp și Stark în 1979. Diferă de tehnicile de blotting de la sud și vest datorită mai multor pași. Cu toate acestea, această tehnică este realizată și prin electroforeză pe gel, blotting și hibridizare cu sonde marcate specifice și detecție. Tehnica Northern blotting se efectuează după cum urmează.
- ARN este extras din probă și separat prin electroforeză pe gel.
- ARN este transferat din gel pe o membrană de blotting și fixat.
- Membrana este tratată cu o sondă marcată preparată din ADNc sau ARN (sonda este complementară unei secvențe specifice din probă).
- Sonda este incubată cu membrana pentru a se lega cu o anumită secvență.
- Sondele nelegate sunt spălate.
- Fragmentele hibridizate sunt detectate de o autoradiografie.
Northern blotting este un instrument important în detectarea și cuantificarea ARNm hibridizat, studierea degradării ARN, evaluarea timpului de înjumătățire al ARN, detectarea splicing-ului ARN, studierea expresiei genelor etc.
Figura 02: Northern Blotting
Ce este Western Blotting?
Western blotting este o metodă de detectare a unei anumite proteine dintr-un amestec de proteine prin utilizarea anticorpului marcat. Prin urmare, Western blot este cunoscut și ca imunblot. Această tehnică a fost introdusă de Towbin și colab. în 1979 și acum este efectuată în mod obișnuit în laboratoare pentru analiza proteinelor. Pașii sunt următorii.
- Proteinele sunt extrase din proba
- Proteinele sunt separate după mărimea lor folosind electroforeză pe gel de poliacrilamidă
- Moleculele separate sunt transferate într-o membrană PVDF sau o membrană de nitroceluloză prin electroporare
- Membrana este blocată pentru legarea nespecifică cu anticorpii
- Proteinele transferate sunt legate cu anticorpi primari (anticorpi marcați cu enzime).
- Membrana este spălată pentru a îndepărta anticorpii primari legați nespecific
- Anticorpii legați sunt detectați prin adăugarea unui substrat și detectarea precipitatului colorat format
Western blotting este util în detectarea anticorpilor anti-HIV într-o probă de ser uman. Western blot poate fi folosit și ca test de confirmare pentru infecția cu hepatită B și test definitiv pentru boala vacii nebune.
Figura 03: Western Blotting
Care este diferența dintre Northern Southern și Western Blotting?
Northern vs Southern vs Western Blotting |
|
| Tip de moleculă detectată | |
| Northern Blotting | Northern blotting detectează o anumită secvență de ARN dintr-o probă de ARN. |
| Southern Blotting | Southern blotting detectează o anumită secvență de ADN dintr-o probă de ADN. |
| Western Blotting | Western blotting detectează o anumită proteină dintr-o probă de proteine. |
| Tip de gel | |
| Northern Blotting | Acest lucru folosește gel de agaroză/formaldehidă. |
| Southern Blotting | Acest lucru folosește un gel de agaroză. |
| Western Blotting | Acest lucru folosește gel de poliacrilamidă. |
| Metoda de ștergere | |
| Northern Blotting | Acesta este un transfer capilar. |
| Southern Blotting | Acesta este un transfer capilar. |
| Western Blotting | Acesta este un transfer electric. |
| sonde folosite | |
| Northern Blotting | sonde cADN sau ARN marcate radioactiv sau neradioactiv. |
| Southern Blotting | Sondele ADN sunt marcate radioactiv sau neradioactiv. |
| Western Blotting | Anticorpii primari sunt utilizați ca sonde. |
| Sistem de detectare | |
| Northern Blotting | Acest lucru se face folosind o autoradiografie sau detectarea luminii sau a modificării culorii. |
| Southern Blotting | Acest lucru se face folosind un autoradiografie, detectarea luminii sau schimbarea culorii. |
| Western Blotting | Acest lucru se face utilizând detectarea luminii sau schimbarea culorii. |
Rezumat – Northern vs Southern vs Western Blotting
Blotting este o tehnică specială dezvoltată pentru identificarea anumitor ADN, ARN sau proteine din probe. Există trei proceduri separate de blotting, și anume nord, sud și vest, pentru a detecta un anumit tip de moleculă. Tehnica Northern blotting este concepută pentru a detecta o secvență specifică de ARN dintr-un amestec de ARN. Tehnica Southern blotting permite detectarea unei anumite secvențe ADN dintr-o probă de ADN, iar tehnica Western blotting este dezvoltată pentru a identifica o anumită proteină dintr-un amestec de proteine.
