Diferența cheie dintre testele PCR convenționale imbricate și în timp real este că PCR convențională este o tehnică dezvoltată pentru a amplifica secvențe specifice de ADN, iar PCR imbricată este o modificare a PCR convențională care constă din două reacții de amplificare secvenţiale, în timp ce reală. -time PCR este o variantă a PCR convențională care este capabilă să cuantifice produsul amplificat.
PCR este o tehnică științifică foarte comună utilizată pe scară largă în cercetare și medicină pentru detectarea ADN-ului. Testele PCR sunt folosite pentru a detecta antigenele prin detectarea ADN-ului sau ARN-ului acestora. În general, ARN-ul viral este prezent în organism înainte de a detecta anticorpi sau de a afișa simptomele bolii. Un test PCR poate spune devreme dacă cineva are sau nu virusul. În prezent, PCR este testul standard pentru detectarea bolii COVID-19. Există diferite tipuri de tehnici PCR, cum ar fi PCR în timp real, PCR imbricată, PCR multiplex, PCR cu pornire la cald și PCR pe distanță lungă etc.
Ce sunt testele PCR convenționale?
Testul PCR convențional este o tehnică de amplificare a ADN-ului in vitro, efectuată în mod obișnuit în laboratoarele de biologice moleculară. Această metodă a permis producerea a mii până la milioane de copii ale unui anumit fragment de ADN. Kary Mullis a introdus această tehnică în 1980. Această tehnică necesită un fragment de ADN cunoscut sub numele de șablon pentru a face multe copii ale acestuia. Taq polimeraza funcționează ca enzimă ADN polimerază și catalizează sinteza de noi catene ale secvenței șablon.
Primerii din amestecul PCR vor funcționa ca puncte de plecare pentru extensiile de fragmente. Toate ingredientele care sunt necesare pentru a face copii ale ADN-ului sunt incluse în amestecul PCR. Reacția PCR este rulată într-o mașină PCR și ar trebui să fie alimentată cu amestecul PCR corect și programul PCR corect. Dacă amestecul de reacție și programul sunt corecte, acesta va produce numărul necesar de copii ale unei anumite secțiuni de ADN dintr-o cantitate foarte mică de ADN.
Figura 01: Test PCR convențional
Există trei etape majore implicate într-o reacție PCR: denaturare, recoacere primer și extinderea catenei. Aceste trei etape au loc la trei temperaturi diferite. Tamponul PCR menține condițiile optime pentru acțiunea polimerazei Taq. Aceste trei etape ale reacției PCR sunt repetate pentru a produce cantitatea necesară de produs PCR. La fiecare reacție PCR, numărul de copii ADN se dublează. Prin urmare, amplificarea exponențială poate fi observată în PCR. Produsul PCR poate fi rezolvat folosind electroforeza pe gel, deoarece produce o cantitate vizibilă de ADN pe un gel și poate fi purificat pentru studii ulterioare, cum ar fi secvențierea.
PCR este un instrument valoros în cercetarea medicală și biologică. Mai ales în studiile criminalistice, PCR are o valoare imensă, deoarece poate amplifica ADN-ul pentru studii din mostre minuscule ale criminalilor și poate face profile ADN criminalistice. PCR este utilizat pe scară largă în multe domenii ale biologiei moleculare, inclusiv genotiparea, clonarea genelor, detectarea mutațiilor, secvențierea ADN-ului, micromatricele ADN și testarea paternității.
Ce sunt testele PCR imbricate?
Nested PCR este un tip de PCR care reduce amplificarea nespecifică a ADN-ului. Există două PCR succesive sau două reacții de amplificare secvenţiale în testul PCR imbricat. În timpul primei reacții de amplificare, se produce un produs PCR. După prima reacție, se efectuează o a doua reacție de amplificare pe produsul PCR al primei reacții. Prin urmare, primerii din al doilea amestec de reacție se leagă de primul produs PCR și îl amplifică.
Figura 02: PCR imbricat
Perechile de amorsare sunt diferite în fiecare reacție. Legarea nespecifică a primerilor este redusă în PCR imbricată. Testele PCR imbricate sunt utile pentru a crește sensibilitatea și/sau specificitatea. Cu toate acestea, PCR imbricată necesită cunoștințe despre secvența interesată.
Ce sunt testele PCR în timp real?
PCR în timp real sau PCR cantitativ (Q PCR) este o versiune modificată a PCR care măsoară cantitativ produsele PCR. Prin urmare, această tehnică cuantifică amplificarea în timp real folosind o mașină PCR în timp real. Este, de asemenea, o metodă adecvată pentru determinarea cantității de secvență țintă sau genă prezentă într-o probă.
Caracteristica interesantă a PCR în timp real este că combină atât amplificarea, cât și cuantificarea reală într-un singur pas. Prin urmare, necesitatea electroforezei pe gel pentru detectare poate fi eliminată prin tehnica PCR în timp real. Utilizarea coloranților fluorescenți pentru a marca produsele PCR în timpul reacțiilor PCR va duce în cele din urmă la cuantificare directă. Când produsele PCR sunt acumulate, semnalele fluorescente sunt, de asemenea, acumulate și vor fi măsurate de mașina în timp real. SYBR Green și Taqman sunt două metode de a detecta sau urmări procesul de amplificare a PCR în timp real. Ambele metode monitorizează progresul procesului de amplificare și raportează cantitatea de produs în timp real.
Figura 03: PCR în timp real
PCR în timp real are o mare varietate de aplicații, cum ar fi cuantificarea expresiei genelor, analiza microARN și ARN necodificator, genotiparea SNP, detectarea variantelor numărului de copii, detectarea mutațiilor rare, detectarea organismelor modificate genetic și detectarea agenților infecțioși.
Care sunt asemănările dintre testele PCR imbricate convenționale și în timp real?
- Testele PCR imbricate și în timp real sunt modificări ale testului PCR convențional.
- Toate cele trei tehnici amplifică probele de ADN.
- Produsele lor pot fi folosite în secvențiere sau analiză.
- Aceste teste necesită primeri.
Care este diferența dintre testele PCR imbricate convenționale și în timp real?
PCR convențională este o tehnică dezvoltată pentru a amplifica secvențe specifice de ADN. Între timp, PCR imbricată este o modificare a PCR convențională care constă din două reacții de amplificare secvențială, iar PCR în timp real este o variantă a PCR convențională care este capabilă să cuantifice produsul amplificat. Deci, aceasta este diferența cheie între testele PCR convenționale imbricate și în timp real. Spre deosebire de PCR convențională și în timp real, PCR imbricată utilizează două seturi de primeri. Mai mult, există două reacții succesive de amplificare în PCR imbricată pentru a reduce amplificarea nespecifică. în plus, testele PCR convenționale și în timp real nu conțin două reacții de amplificare secvenţiale.
Următorul infografic enumeră diferențele dintre testele PCR imbricate convenționale și cele în timp real în formă tabelară pentru comparare alăturată.
Rezumat – Teste convenționale vs imbricate vs teste PCR în timp real
PCR convențională este prima tehnică dezvoltată pentru a amplifica fragmente specifice de ADN. PCR imbricată și PCR în timp real sunt două variante ale PCR convenționale. Există două reacții de amplificare secvențială și utilizarea a două seturi de primeri în PCR imbricată. PCR în timp real este dezvoltat pentru a cuantifica produsul PCR amplificat. Astfel, aceasta rezumă diferența dintre testele PCR convenționale imbricate și în timp real.
