Diferența cheie – Secvențierea NGS vs Sanger
Next Generation Sequencing (NGS) și Sanger Sequencing sunt două tipuri de tehnici de secvențiere a nucleotidelor dezvoltate de-a lungul timpului. Metoda de secvențiere Sanger a fost utilizată pe scară largă de mulți ani și NGS a înlocuit-o recent datorită avantajelor sale. Diferența cheie dintre NGS și Sanger Sequencing este că NGS funcționează pe principiul secvențialării a milioane de secvențe simultan într-un mod rapid printr-un sistem de secvențiere, în timp ce Sanger Sequencing funcționează pe principiul terminarii lanțului datorită încorporării selective a dideoxinucleotidelor de către enzima ADN polimerază. în timpul replicării ADN-ului și separării fragmentelor rezultate prin electroforeză capilară.
Ce este secvențierea nucleotidelor?
Informația genetică este stocată în secvențele de nucleotide ale ADN-ului sau ARN-ului unui organism. Procesul de determinare a ordinii corecte a nucleotidelor (folosind patru baze) într-un fragment dat (într-o genă, un grup de gene, un cromozom și un genom complet) este cunoscut sub numele de secvențierea nucleotidelor. Este foarte important în studiile genomice, studiile criminalistice, virologie, sistematică biologică, diagnosticul medical, biotehnologie și în multe alte domenii să se analizeze structura și funcția genelor. Există diferite tipuri de metode de secvențiere dezvoltate de oamenii de știință. Printre acestea, secvențierea Sanger dezvoltată de Frederick Sanger în 1977 a fost folosită și popularizată pe scară largă pentru o perioadă lungă de timp, până când Next Generation Sequencing a înlocuit-o.
Ce este NGS?
Next Generation Sequencing (NGS) este un termen folosit pentru a face referire la procesele moderne de secvențiere cu randament ridicat. Descrie o serie de tehnologii moderne de secvențiere care au revoluționat studiile genomice și biologia moleculară. Aceste tehnici sunt secvențierea Illumina, secvențierea Roche 454, secvențierea Ion Proton și secvențierea SOLiD (Sequencing by Oligo Ligation Detection). Sistemele NGS sunt mai rapide și mai ieftine. În sistemele NGS sunt utilizate patru metode principale de secvențiere a ADN-ului și anume; pirosecvențierea, secvențierea prin sinteză, secvențierea prin ligatură și secvențierea semiconductoare ionice. Un număr mare de catene de ADN sau ARN (milioane de) pot fi secvențiate paralel. Permite secvențierea întregului genom al organismelor într-o perioadă scurtă de timp, spre deosebire de secvențierea Sanger, care necesită mai mult timp.
NGS are multe avantaje față de metoda convențională de secvențiere Sanger. Este un proces de mare viteză, mai precis și mai rentabil, care poate fi efectuat cu o dimensiune mică a eșantionului. NGS poate fi utilizat în studii metagenomice, în detectarea variațiilor în interiorul unui genom individual datorate inserțiilor și delețiilor etc. și în analiza expresiilor genelor.
Figura_1: Evoluții în secvențierea NGS
Ce este Sanger Sequencing?
Secvențierea Sanger este o metodă de secvențiere dezvoltată de Frederick Sanger și colegii săi în 1977 pentru a determina ordinea precisă a nucleotidelor unui fragment de ADN dat. Este, de asemenea, cunoscut sub numele de secvențiere de terminare a lanțului sau secvențiere Dideoxy. Principiul de funcționare al acestei metode este terminarea sintezei catenei prin încorporarea selectivă a dideoxinucleotidelor de terminare a lanțului (ddNTPs) cum ar fi ddGTP, ddCTP, ddATP și ddTTP de către ADN polimeraza în timpul replicării ADN-ului. Nucleotidele normale au grupări 3’ OH pentru formarea unei legături fosfodiester între nucleotidele adiacente pentru a continua formarea catenei. Cu toate acestea, ddNTP-urilor le lipsește această grupare 3’ OH și nu sunt capabile să formeze legături fosfodiester între nucleotide. Prin urmare, alungirea lanțului este încetată.
În această metodă, ADN-ul monocatenar care urmează să fie secvențial servește ca șirnă șablon pentru sinteza ADN in vitro. Alte cerințe sunt primerul oligonucleotid, precursorii deoxinucleotid și enzima ADN polimerază. Când se cunosc capetele de flancare ale fragmentului țintă, primerii pot fi proiectați cu ușurință pentru replicarea ADN-ului. Patru reacții separate de sinteză ADN sunt efectuate în patru tuburi separate. Fiecare tub are ddNTP-uri separate, împreună cu alte cerințe. Din nucleotida particulară, se adaugă un amestec de dNTP-uri și ddNTP-uri. De asemenea, patru reacții separate sunt efectuate în patru tuburi cu patru amestecuri. După reacții, se realizează detectarea fragmentelor de ADN și conversia modelului de fragment în informații de secvență. Fragmentele de ADN rezultate sunt denaturate la căldură și separate prin electroforeză pe gel. Dacă sunt utilizate nucleotide radioactive, modelul de benzi din gelul de poliacrilamidă poate fi vizualizat prin autoradiografie. Atunci când această metodă folosește dideoxinucleotidele marcate fluorescent, aceasta poate fi atenuată pe gelul citit și trecută printr-un fascicul de laser pentru a fi detectat de detectorul fluorescent. Pentru a evita erorile care ar putea apărea atunci când o secvență este citită cu ochiul și introducerea manuală într-un computer, această metodă s-a dezvoltat în utilizarea unui secvențietor automat cuplat cu computerul.
Aceasta este metoda folosită pentru a secvența ADN-ul din proiectul Genom uman. Această metodă este încă utilizată cu modificări avansate, deoarece oferă informații precise despre secvență, în ciuda faptului că este un proces costisitor și lent.
Figura_2: Secvențierea Sanger
Care este diferența dintre NGS și Sanger Sequencing?
NGS vs Sanger Sequencing |
|
| Next Generation Sequencing (NGS) se referă la procesele moderne de secvențiere cu debit mare. Descrie o serie de tehnologii moderne de secvențiere | Secvențierea Sanger este o metodă de secvențiere dezvoltată de Frederick Sanger pentru a determina ordinea precisă a nucleotidelor unui fragment de ADN dat. |
| Eficiența costurilor | |
| NGS este un proces mai ieftin, deoarece reduce timpul, puterea umană și substanțele chimice. | Acesta este un proces costisitor, deoarece necesită timp, forță umană și mai multe substanțe chimice. |
| Viteza | |
| Acest lucru este mai rapid, deoarece atât detectarea chimică, cât și detectarea semnalului multor fire au loc în paralel. | Acest lucru necesită mult timp, deoarece detectarea chimică și detectarea semnalului au loc ca două procese separate și numai pe fir poate fi citită o dată. |
| Fiabilitate | |
| NGS este de încredere. | Secvențierea Sanger este mai puțin fiabilă |
| Dimensiune eșantion | |
| NGS necesită o cantitate mai mică de ADN. | Această metodă necesită o cantitate mare de ADN șablon. |
| baze ADN per fragment secvențial | |
| Numărul de baze ADN per fragment secvențial este mai mic decât metoda Sanger | Secvențele de generare sunt mai lungi decât secvențele NGS. |
Rezumat – NGS vs Sanger Sequencing
NGS și Sanger Sequencing sunt tehnici de secvențiere a nucleotidelor utilizate pe scară largă în biologia moleculară. Secvențierea Sanger este o metodă de secvențiere timpurie care a fost înlocuită cu NGS. Principala diferență dintre NGS și Sanger Sequencing este că NGS este un proces de mare viteză, mai precis și mai rentabil decât secvențierea Sanger. Ambele tehnici au creat focare majore în genetică și biotehnologie.
