Diferența cheie – Secvențierea Sanger vs Pyrosequencing
Secvențierea ADN-ului este foarte importantă pentru analiza ADN-ului, deoarece cunoașterea aranjamentului corect al nucleotidelor pe o anumită regiune ADN-ului dezvăluie multe informații importante despre aceasta. Există diferite metode de secvențiere a ADN-ului. Secvențierea Sanger și Pyrosequencing sunt două metode diferite de secvențiere ADN utilizate pe scară largă în biologia moleculară. Diferența esențială dintre secvențierea Sanger și Pyrosequencing este că secvențierea Sanger utilizează dideoxinucleotidele pentru a termina sinteza ADN-ului pentru a citi secvența de nucleotide, în timp ce pirosecvențierea detectează eliberarea de pirofosfat prin încorporarea nucleotidelor și sintetizarea secvenței complementare pentru a citi ordinea precisă a secvenței.
Ce este Sanger Sequencing?
Secvențierea Sanger este o metodă de secvențiere a ADN-ului de prima generație dezvoltată de Frederick Sanger și colegiile sale în 1977. Este, de asemenea, cunoscută sub denumirea de secvențiere a terminării lanțului sau secvențierea dideoxi, deoarece se bazează pe terminarea lanțului de către dideoxinucleotide (ddNTP). Această metodă a fost utilizată pe scară largă timp de mai bine de 30 de ani până când a fost dezvoltată secvențierea de nouă generație (NGS). Tehnica de secvențiere Sanger a permis descoperirea ordinii corecte a nucleotidelor sau atașarea unui anumit fragment de ADN. Se bazează pe încorporarea selectivă a ddNTP-urilor și terminarea sintezei ADN-ului în timpul replicării ADN in vitro. Absența grupărilor 3’ OH pentru a continua formarea legăturii fosfodiester între nucleotidele adiacente este o caracteristică unică a ddNTPs. Prin urmare, odată ce ddNTP este atașat, alungirea lanțului încetează și se termină din acel punct. Există patru ddNTP-uri – ddATP, ddCTP, ddGTP și ddTTP – utilizate în secvențierea Sanger. Aceste nucleotide opresc procesul de replicare a ADN-ului atunci când sunt încorporate în catena de ADN în creștere și au ca rezultat lungimi diferite de ADN scurt. Electroforeza pe gel capilar este utilizată pentru a organiza aceste catene scurte de ADN după dimensiunile lor pe un gel, așa cum se arată în Figura 01.
Figura 1: Electroforeza pe gel capilar a ADN-ului scurt sintetizat
Pentru replicarea in vitro a ADN-ului, trebuie furnizate câteva cerințe. Acestea sunt enzime ADN polimerază, ADN șablon, primeri oligonucleotidici și deoxinucleotide (dNTP). În secvențierea Sanger, replicarea ADN-ului este efectuată în patru eprubete separate, împreună cu patru tipuri de ddNTP-uri separat. Deoxinucleotidele nu sunt înlocuite total de ddNTP-urile respective. Un amestec de dNTP particular (de exemplu; dATP + ddATP) este inclus în tub și replicat. Patru produse tubulare separate sunt rulate pe un gel în patru godeuri separate. Apoi, citind gelul, secvența poate fi construită așa cum se arată în Figura 02.
Figura 02: secvențierea Sanger
Secvențierea Sanger este o tehnică importantă care ajută în multe domenii ale biologiei moleculare. Proiectul genomului uman a fost finalizat cu succes cu ajutorul metodelor bazate pe secvențierea Sanger. Secvențierea Sanger este, de asemenea, utilă în secvențierea ADN-ului țintă, cercetarea cancerului și a bolilor genetice, analiza expresiei genelor, identificarea umană, detectarea agenților patogeni, secvențierea microbiană etc.
Există mai multe dezavantaje ale secvențierii Sanger:
- Lungimea ADN-ului care este secvențial nu poate fi mai mare de 1000 de perechi de baze
- Numai o singură componentă poate fi secvențială la un moment dat.
- Procesul consumă mult timp și este costisitor.
De aceea, noi tehnici avansate de secvențiere au fost dezvoltate cu timpul pentru a depăși aceste probleme. Cu toate acestea, secvențierea Sanger este încă în uz datorită rezultatelor sale extrem de precise, de până la aproximativ 850 de fragmente de lungime perechi de baze.
Ce este pirosecventarea?
Pyrosequencing este o nouă tehnică de secvențiere ADN bazată pe „secvențierea prin sinteză”. Această tehnică se bazează pe detectarea eliberării de pirofosfat la încorporarea nucleotidelor. Procesul este folosit de patru enzime diferite: ADN polimerază, ATP sulfurilază, luciferază și apiraza și două substraturi adenozină 5’ fosfosulfat (APS) și luciferină.
Procesul începe cu legarea primerului cu șablonul ADN monocatenar și ADN polimeraza începe încorporarea nucleotidelor complementare acestuia. Când nucleotidele se unesc între ele (polimerizarea acidului nucleic), eliberează grupe de pirofosfat (două grupări de fosfat legate între ele) și energie. Fiecare adăugare de nucleotide eliberează o cantitate echimolară de pirofosfat. Pirofosfatul se transformă în ATP de către ATP sulfurilază în prezența substratului APS. ATP-ul generat conduce la conversia mediată de luciferază a luciferinei în oxiluciferină, producând lumină vizibilă în cantități proporționale cu cantitatea de ATP. Lumina este detectată de un dispozitiv de detectare a fotonilor sau de un fotomultiplicator și creează o pirogramă. Apiraza degradează ATP și dNTP-urile neîncorporate în amestecul de reacție. Adăugarea dNTP se face o dată la un moment dat. Deoarece adăugarea de nucleotide este cunoscută în funcție de încorporarea și detectarea luminii, secvența șablonului poate fi determinată. Pirograma este utilizată pentru generarea secvenței de nucleotide a probei de ADN, așa cum se arată în Figura 03.
Pyrosequencing este foarte importantă în analiza polimorfismului de un singur nucleotide și secvențierea unor scurte porțiuni de ADN. Precizia ridicată, flexibilitatea, ușurința automatizării și procesarea paralelă sunt avantajele pirosecvențierii față de tehnicile de secvențiere Sanger.
Figura 03: Pirosecvențierea
Care este diferența dintre Sanger Sequencing și Pyrosequencing?
Secvențierea Sanger vs Pyrosequencing |
|
| Secvențierea Sanger este o metodă de secvențiere ADN bazată pe încorporarea selectivă a ddNTP-urilor de către ADN polimerază și terminarea lanțului. | Pyrosequencing este o metodă de secvențiere ADN bazată pe detectarea eliberării de pirofosfat la încorporarea nucleotidelor. |
| Utilizarea ddNTP | |
| ddNTP-uri sunt folosite pentru a termina replicarea ADN | ddNTP-uri nu sunt utilizate. |
| Enzime implicate | |
| Se utilizează ADN polimerază. | Se folosesc patru enzime: ADN polimerază, ATP sulfurilază, luciferaza și apiraza. |
| Substraturi folosite | |
| APS și Luciferin nu sunt utilizate. | Se folosesc fosfosulfat de adenozină 5’ (APS) și luciferină. |
| Temperatura maximă | |
| Acesta este un proces lent. | Acesta este un proces rapid. |
Rezumat – Sanger Sequencing vs Pyrosequencing
Secvențierea Sanger și Pyrosequencing sunt două metode de secvențiere ADN utilizate în biologia moleculară. Secvențierea Sanger construiește ordinea nucleotidelor în secvență prin terminarea alungirii lanțului în timp ce pirosecvențierea construiește ordinea precisă a nucleotidelor în secvență prin încorporarea nucleotidelor și detectarea eliberării pirofosfaților. Prin urmare, principala diferență dintre secvențierea Sanger și Pyrosequencing este că secvențierea Sanger funcționează la secvențierea prin terminarea lanțului, în timp ce pirosecvențierea funcționează la secvențierea prin sinteză.
