Diferența cheie – Maxam Gilbert vs Sanger Sequencing
Nucleotidele sunt unitățile structurale de bază și blocurile de construcție ale ADN-ului. Molecula de ADN este compusă dintr-un lanț polinucleotidic. Există patru nucleotide diferite găsite în ADN. Aceste nucleotide sunt compuse din patru baze azotate diferite numite A (adenină), G (guanină), C (citozină), T (timină). Ordinea nucleotidelor din molecula de ADN are o mare importanță deoarece codifică o informație genetică importantă pentru creșterea și dezvoltarea organismelor. Secvențierea ADN se referă la procesul care determină secvența precisă de nucleotide a ADN-ului. Există diferite metode de secvențiere a ADN-ului. Secvențierea Maxam Gilbert și secvențierea ADN-ului Sanger sunt două metode de secvențiere ADN care aparțin secvențierii de prima generație. Procedura de secvențiere Maxam Gilbert determină secvența de baze prin scindarea chimică a fragmentelor de ADN marcate la capătul 5’, de preferință la fiecare dintre cele patru nucleotide și electroforeza pe gel. Procedura de secvențiere Sanger determină secvența de nucleotide prin sintetizarea ADN-ului monocatenar folosind ADN polimerază și dideoxinucleotide și electroforeză pe gel. Aceasta este diferența cheie dintre Maxam Gilbert și Sanger Sequencing.
Ce este Maxam Gilbert Sequencing?
Secvențierea Maxam Gilbert, cunoscută și ca metodă de secvențiere chimică, este o tehnică care a fost dezvoltată pentru a determina ordinea nucleotidelor din ADN. Această metodă a fost introdusă de W alter Gilbert și Alan Maxam în 1976 și a devenit populară deoarece poate fi efectuată direct cu ADN purificat. Metoda Maxam Gilbert aparține primei generații de secvențiere ADN și a fost prima metodă de secvențiere folosită pe scară largă de oamenii de știință.
Principiul de bază al acestei metode constă în limitarea fragmentelor de ADN marcate la capăt la baze specifice prin substanțe chimice și condiții specifice bazei și separarea fragmentelor marcate prin electroforeză, așa cum se arată în figura 01. Fragmentele sunt separate conform la dimensiunile lor pe gel. Deoarece fragmentele sunt etichetate, secvența moleculei de ADN poate fi dedusă cu ușurință.
Metoda Maxam Gilbert utilizează substanțe chimice specifice de bază pentru a sparge ADN-ul la anumite baze. Două substanțe chimice comune numite dimetil sulfat și hidrazină sunt folosite pentru a ataca selectiv purinele și, respectiv, pirimidinele.
Metoda de secvențiere Maxam Gilbert este efectuată prin mai mulți pași, după cum urmează.
- Purificarea secvenței ADN folosind endonucleaze de restricție
- Etichetarea capetelor fragmentelor de ADN prin adăugarea de fosfați radioactivi
- Purificarea fragmentelor marcate din fragmente nemarcate prin electroforeză pe gel
- Separarea ADN-ului etichetat la capăt în patru tuburi și tratarea separat cu substanțe chimice specifice de bază
- Electroforeza conținutului fiecărui tub pe linii separate pe un gel și separarea fragmentelor în funcție de lungimea acestora.
- Detecția fragmentelor prin autoradiografie.
Figura 01: Secvențierea Maxam Gilbert
Ce este Sanger Sequencing?
Secvențierea Sanger este o metodă de secvențiere dezvoltată de Frederick Sanger și colegii săi în 1977 pentru a determina secvența de bază a unui fragment de ADN dat. Este cunoscută și sub denumirea de secvențiere a terminației lanțului sau metoda de secvențiere Dideoxy. Această metodă funcționează pe principiul încorporării selective a dideoxinucleotidelor cu terminare a lanțului (ddNTPs) cum ar fi ddGTP, ddCTP, ddATP și ddTTP de către ADN polimeraza în timpul sintezei ADN-ului monocatenar pentru a termina formarea catenei. Dideoxinucleotidele nu au grupări 3’ OH pentru formarea de legături fosfodiester cu nucleotidele adiacente. Prin urmare, formarea șuviței se oprește odată ce un ddNTP este încorporat în șuvița nou formată în timpul secvențierii Sanger.
În această metodă, patru reacții separate de sinteză a ADN-ului (PCR) sunt efectuate în patru tuburi separate cu un tip de ddNTP. Alte cerințe sunt, de asemenea, furnizate pentru tuburile pentru PCR, inclusiv primeri, dNTP-uri, polimeraza Taq, condiții specifice etc. Patru reacții separate sunt efectuate în patru tuburi cu patru amestecuri. După reacțiile PCR, fragmentele de ADN rezultate sunt denaturate la căldură și separate prin electroforeză pe gel. Apoi fragmentele sunt vizualizate folosind fie un primer marcat (radioactiv sau fluorescent), fie dNTP, așa cum se arată în figura 02.
Figura 02: Secvențierea Sanger
Care este diferența dintre Maxam Gilbert și Sanger Sequencing?
Maxam Gilbert vs Sanger Sequencing |
|
| Secvențierea Maxam Gilbert este prima tehnică dezvoltată pentru secvențierea ADN. | Metoda de secvențiere Sanger a fost introdusă după metoda de secvențiere Maxam Gilbert. |
| Utilizare | |
| Această metodă este rar folosită. | Secvențierea Sanger este folosită în mod obișnuit pentru secvențiere. |
| Utilizarea substanțelor chimice periculoase | |
| Folosește substanțe chimice periculoase. | Utilizarea substanțelor chimice periculoase este limitată în comparație cu metoda Maxam Gilbert. |
| Etichetare pentru detectare | |
| Această metodă folosește P32 radioactiv pentru etichetarea capetelor fragmentelor de ADN. | Secvențierea Sanger utilizează ddNTP-uri marcate radioactiv sau fluorescent. |
Rezumat – Maxam Gilbert vs Sanger Sequencing
Secvențierea Maxam Gilbert și Sanger sunt două tipuri de tehnici de secvențiere ADN care fac parte din secvențierea ADN-ului de prima generație. Secvențierea Maxam Gilbert este prima metodă introdusă pentru secvențierea ADN-ului în 1976 și este realizată prin spargerea fragmentelor de ADN marcate la capăt cu substanțe chimice specifice bazei. Prin urmare, este cunoscută sub denumirea de secvențiere chimică. Metoda de secvențiere Sanger a fost introdusă în 1977 și se bazează pe reacțiile de terminare în lanț conduse de ddNTP. Metoda de secvențiere Sanger populară decât metoda Maxam Gilbert datorită mai multor dezavantaje ale metodei Maxam Gilbert, cum ar fi consumul excesiv de timp, utilizarea de substanțe chimice periculoase etc. Aceasta este diferența dintre secvențierea Maxam Gilbert și Sanger.
