Diferența cheie – Clonarea genelor vs PCR
Sinteza multor copii de ADN dintr-un anumit fragment de ADN se numește amplificare ADN. Există două procese principale de amplificare a ADN-ului și anume clonarea genelor și PCR. Diferența cheie dintre clonarea genelor și PCR este că clonarea genei produce copii multiple ale unei anumite gene in vivo prin construirea unui ADN recombinat și creșterea în interiorul unei bacterii gazdă, în timp ce PCR produce milioane de copii ale unui fragment specific de ADN in vitro, care suferă cicluri repetate de denaturare și sinteza.
Ce este clonarea genelor?
Clonarea genelor este o tehnică folosită pentru a localiza și multiplica o anumită genă din ADN-ul genomic extras al unui organism prin construirea ADN-ului recombinant. ADN-ul genomic conține mii de gene diferite codificate pentru proteine. Când ADN-ul este extras, acesta include toate genele posibile pe care le poate suporta. Tehnica de clonare a genelor a permis detectarea unei anumite gene din ADN-ul total. Prin urmare, clonarea genelor servește ca un instrument important în biologia moleculară.
Realizarea unei biblioteci genomice a unui organism este esențială în clonarea genelor dacă nu există nici un indiciu despre locația genei relevante în ADN. Se realizează o bibliotecă genomică folosind următorii pași.
Pasul 1: Extragerea ADN-ului total dintr-un organism care conține gena dorită.
Pasul 2: Restricționați digestia ADN-ului extras pentru a produce fragmente mici ușor de gestionat. Acest pas este facilitat de endonucleazele de restricție.
Pasul 3: Selectarea unui vector adecvat și deschiderea ADN-ului vector folosind aceleași endonucleaze de restricție. Plasmidele bacteriene sunt utilizate în mod obișnuit ca vectori pentru a transporta ADN străin. Plasmidele sunt cercuri mici de ADN situate în bacterii.
Pasul 4: Combinarea ADN-ului vector și ADN fragmentat pentru a produce moleculă de ADN recombinant. Acest pas este guvernat de ADN ligaza.
Pasul 5: Transferul moleculelor de ADN recombinat în bacterii gazdă. Acest pas este cunoscut sub numele de transformare și se face folosind un șoc termic.
Pasul 5: Screening-ul celulelor bacteriene transformate pe un mediu de cultură. La sfârșitul procesului de transformare se obține o populație mixtă de celule gazdă transformate și netransformate. Deoarece gena de interes include numai în celulele gazdă transformate. Prin urmare, este necesar să selectați celulele transformate. Selecția se face folosind medii selective care conțin antibiotice. Doar celulele transformate cresc pe acest mediu de screening, permițând selecția.
Pasul 6: Creșterea bacteriilor pentru a produce o bibliotecă de gene. În această etapă, celulele gazdă transformate sunt introduse în mediu de cultură proaspăt care asigură cerințe optime de creștere. Coloniile totale de pe plăcile de cultură reprezintă biblioteca genomică a acelui organism.
Pasul 7: Molecula de ADN recombinant care conține gena de interes trebuie analizată din mii de fragmente donate de ADN recombinat. Poate fi realizat prin utilizarea de sonde care marchează gena specifică sau proteinele specifice rezultate din acea genă.
Odată ce gena interesată care conține colonia bacteriană este identificată din totalul coloniilor, este posibil să se facă milioane de copii ale plasmidei recombinate care conține gena.
Clonarea genelor este folosită în stabilirea bibliotecilor de gene, producerea de proteine speciale, vitamine, antibiotice, hormoni, secvențierea și cartografierea genomilor organismelor, realizarea de copii multiple ale ADN-ului indivizilor în criminalistică etc.
Figura_1: Clonarea genelor
Ce este PCR?
Reacția în lanț a polimerazei (PCR) este o tehnică care generează un număr mare de copii ale unui anumit fragment de ADN. Amplificarea exponențială a unei secvențe specifice de ADN este obținută prin PCR în condiții in vitro. Această tehnică este un instrument foarte puternic în biologia moleculară, deoarece poate multiplica o mică probă de ADN într-o cantitate utilizabilă. PCR a fost introdus de Kary Mullis în 1983 și această invenție câștigătoare a premiului a creat un progres uriaș în biologia moleculară.
Tehnica
PCR urmează reacții PCR repetate, așa cum se arată în Figura 02. O reacție PCR constă din trei etape principale care au loc la trei temperaturi diferite; denaturarea dublu catenară la ADN la 94 0C, recoacere a primerilor la 68 0C și alungirea catenei la 72 0 C. Prin urmare, atunci când se efectuează PCR, fluctuația temperaturii ar trebui menținută în mare măsură pentru o replicare adecvată. PCR se efectuează într-o mașină PCR în interiorul tuburilor PCR. Tuburile PCR sunt încărcate cu amestecuri PCR corecte care conțin ADN șablon, polimerază Taq, primeri, dNTP și tampon. Denaturarea probei de ADN dublu catenar în ADN monocatenar se face prin ruperea legăturilor de hidrogen dintre bazele complementare la 94 – 98 0C. Apoi, catenele simple de ADN matriță sunt expuse pentru primeri. Trebuie furnizate o pereche de grunduri (în față și invers) și ar trebui să fie termostabili pentru a tolera temperaturile ridicate. Primerii sunt secvențe scurte de ADN monocatenar complementare capete ale fragmentului de ADN țintă. Primerii sintetici sunt utilizați în PCR. Primerii se leagă de bazele complementare ale probei de ADN și inițiază sinteza unei noi catene. Această etapă este catalizată de o enzimă numită polimerază Taq; o enzimă ADN polimerază termostabilă izolată din Thermus auqaticus. Când sunt disponibili primeri și nucleotide (blocuri de construcție), polimeraza Taq construiește noua catenă de ADN complementară ADN-ului șablon. La sfârșitul programului PCR, fragmentul de ADN amplificat este observat folosind electroforeza pe gel. Dacă este necesară o analiză suplimentară, produsul PCR este purificat din gel.
PCR este foarte utilă pentru diagnosticarea și monitorizarea bolilor genetice și dobândite, identificarea infractorilor (în domeniul criminalisticii), studierea structurii și funcției unui segment vizat de ADN, secvențierea și cartografierea genomului organismelor, etc. PCR a devenit o tehnică de laborator de rutină în laboratoarele de cercetare în biologie medicală și moleculară în rândul oamenilor de știință, deoarece are o mare varietate de aplicații.
Figura_2: Reacția în lanț a polimerazei
Care este diferența dintre Gene Cloning și PCR?
Clonarea genelor vs PCR |
|
| Clonarea genelor este procesul de realizare a mai multor copii ale unei anumite gene in vivo prin ADN recombinant și de transformare într-o bacterie gazdă. | Tehnica PCR produce mai multe copii ale unei anumite secvențe de ADN in vitro prin cicluri repetate de reacții PCR. |
| Cerința de construcție a ADN recombinant | |
| ADN-ul recombinant este produs pentru a localiza gena. | ADN recombinant nu este produs. |
| Nevoie de muncă | |
| Acest proces necesită forță de muncă. | Nu este nevoie de travaliu intensiv. |
| Proces in vivo sau in vitro | |
| Constructia ADN-ului recombinant este in vitro, iar amplificarea ADN-ului in vivo. | Amplificarea ADN-ului are loc complet in vitro. |
Rezumat – Clonarea genelor vs PCR
Clonarea genelor și PCR sunt două metode utilizate pentru amplificarea ADN-ului. PCR este un proces in vitro care realizează mai multe copii ale ADN-ului unui anumit fragment de ADN fără a utiliza ADN recombinant și un organism gazdă. Clonarea genelor este în primul rând un proces in vivo care are ca rezultat copii multiple ale unei gene interesate în interiorul organismului gazdă prin construirea ADN-ului recombinant. Aceasta este diferența dintre clonarea genelor și PCR.
