Diferență cheie – RT PCR vs QPCR
Reacția în lanț a polimerazei este o tehnică utilizată pentru a amplifica o anumită regiune a ADN-ului in vitro. Datorită inventării acestei tehnici de către Kary Mullis în 1983, oamenii de știință sunt capabili să facă mii până la milioane de copii ale fragmentelor specifice de ADN în scopuri de cercetare. În prezent, a devenit o tehnică comună și efectuată în mod obișnuit în laboratoarele clinice și de cercetare pentru o varietate largă de aplicații. Există variații ale tehnicii PCR tradiționale, cum ar fi RT PCR, PCR imbricată, PCR multiplex, Q PCR, RT – QPCR, etc. RT PCR și Q PCR sunt două variații importante ale PCR. Diferența cheie dintre RT PCR și Q PCR este că RT PCR este utilizată pentru a detecta expresia genelor prin crearea de transcripte ADN complementare (cADN) din ARN, în timp ce Q PCR este utilizată pentru a măsura cantitativ produsele PCR în timp real folosind coloranți fluorescenți.
Ce este RT PCR?
Reacția în lanț a polimerazei cu transcripție inversă (RT PCR) este o variantă a PCR care este utilizată pentru a detecta expresia ARN. Este o metodă foarte importantă pentru detectarea expresiei ARNm în țesuturi. RT PCR este utilizată atunci când materialul de pornire al probei este ARN. În RT PCR, mARN-ul matriță este mai întâi convertit în ADN complementar. Această etapă este catalizată de enzima transcriptază inversă și procesul este cunoscut sub numele de transcripție inversă. În al doilea rând, PCR tradițională este folosită pentru ADNc nou sintetizat pentru amplificare.
RT PCR este o tehnică extrem de sensibilă care necesită o cantitate relativ mică de probă de ARN. RT PCR este utilizat în mod obișnuit în diagnosticarea și cuantificarea speciilor de ARN, în special a virusurilor ARN, cum ar fi virusul imunodeficienței umane și virusul hepatitei C.
Figura 01: Tehnica RT PCR
Ce este QPCR?
PCR cantitativ (QPCR) este o variantă a PCR care este utilizată pentru a măsura cantitativ produsele PCR. De asemenea, este denumită reacție în lanț a polimerazei în timp real, deoarece măsoară amplificarea în timp real folosind mașina PCR în timp real. Este o metodă adecvată pentru determinarea cantității de secvență țintă sau genă prezentă într-o probă. Caracteristica interesantă a QPCR este că combină atât amplificarea, cât și cuantificarea adevărată într-un singur pas. Prin urmare, necesitatea electroforezei pe gel în detecție poate fi eliminată prin tehnica QPCR. QPCR folosește coloranți fluorescenți pentru a marca produsele PCR în timpul reacțiilor PCR, care în cele din urmă conduc la cuantificare directă. Când produsele PCR se acumulează, semnalele fluorescente sunt de asemenea acumulate și vor fi măsurate de mașina în timp real. QPCR poate fi combinat cu RT PCR. Este cunoscut sub numele de RT – QPCR sau QRT – PCR și este considerată cea mai puternică, sensibilă și cantitativă metodă pentru detectarea nivelurilor de ARN în celule sau țesuturi.
SYBR Green și Taqman sunt două metode folosite pentru a detecta sau urmări procesul de amplificare a PCR în timp real. Metoda SYBR Green este realizată folosind un colorant fluorescent numit SYBR green și detectează amplificarea prin legarea colorantului pentru a produce ADN dublu catenar. Taqman se efectuează folosind sonde cu două etichete și detectează amplificarea prin degradarea sondei de către polimeraza Taq și eliberările de fluorofor, așa cum se arată în figura 02. Ambele metode monitorizează progresul procesului de amplificare și raportează cantitatea de produs în timp real..
PCR în timp real are o mare varietate de aplicații, cum ar fi cuantificarea expresiei genelor, analiza microARN și ARN noncoding, genotiparea SNP, detectarea variantelor numărului de copii, detectarea mutațiilor rare, detectarea organismelor modificate genetic, detectarea agenților infecțioși, etc.
Figura 02: Tehnica PCR cantitativă
Care este diferența dintre RT PCR și QPCR?
RT PCR vs QPCR |
|
| RT PCR este o tehnică folosită pentru a detecta expresia genelor prin amplificare. | QPCR este o tehnică care amplifică ADN-ul și cuantifică produsele PCR în timp real. |
| Implicarea enzimei transcriptazei inverse | |
| Transcriptaza inversă enzimatică este utilizată pentru RT PCR. | Reverse transcriptaza enzimatică nu este utilizată pentru QPCR. |
| Utilizarea moleculelor marcate fluorescent | |
| Coloranții sau sondele marcați fluorescent nu sunt utilizați pentru RT PCR. | Pentru QPCR se folosesc coloranți sau sonde marcate fluorescent. |
| Cuantificarea produsului PCR | |
| Cu excepția cazului în care este cuplat cu QPCR, RT PCR nu cuantifică produsul PCR. | QPCR măsoară cantitativ produsul PCR. |
| Materiale inițiale | |
| Materialul inițial este ARNm. | Materialul inițial este ADN. |
| Sinteza ADNc | |
| ADN-ul complementar este produs în timpul RT PCR. | ADN-ul complementar nu este produs în timpul QPCR. |
Rezumat – RT PCR vs QPCR
RT PCR și QPCR sunt două versiuni ale PCR tradiționale. Tehnica RT PCR este efectuată pentru probele de ARNm și este condusă de transcripția inversă și producția de ADNc. QPCR este utilizat pentru a cuantifica produsele PCR în timpul ciclurilor termice PCR în timp real folosind coloranți fluorescenți sau sonde marcate. În QPCR, cantitatea de produs PCR este reprezentată de semnalele fluorescente emise de probă. RT PCR este utilizat în mod obișnuit ca proces de amplificare, în timp ce QPCR este utilizat în mod obișnuit ca proces de cuantificare. Aceasta este diferența dintre RT PCR și QPCR.
