Diferența cheie – hârtie vs strat subțire vs cromatografie pe coloană
Cromatografia pe hârtie, cromatografia în strat subțire și cromatografia pe coloană sunt trei tipuri de tehnici cromatografice. Diferența cheie dintre cromatografia pe hârtie, cromatografia în strat subțire și cromatografia pe coloană se bazează pe tipul de fază staționară utilizată în tehnica cromatografiei. Cromatografia pe hârtie folosește o hârtie de celuloză ca fază staționară, cromatografia în strat subțire folosește alumină sau silicagel ca fază staționară, în timp ce cromatografia pe coloană folosește o coloană plină cu un material matrice adecvat ca fază staționară.
În procesul de separare și identificare a biomoleculelor precum proteinele și carbohidrații, cromatografia este o tehnică biofizică importantă folosită. Cromatografia separă compușii pe baza solubilității, mărimii și încărcăturii lor. Pe baza mecanismului de separare, cromatografia folosește mecanisme precum schimbul de ioni, absorbția, partiția și excluderea mărimii și există trei tehnici cromatografice; și anume hârtie, strat subțire și cromatografia pe coloană. Cromatografia pe hârtie se bazează pe adsorbția solid-lichid și pe solubilitatea compusului și folosește o hârtie de celuloză ca fază staționară. Cromatografia în strat subțire se bazează pe adsorbția solid-lichid a moleculelor. Are o fază staționară care este de obicei făcută din alumină sau silicagel și faza mobilă care este solventul. Cromatografia pe coloană utilizează o coloană plină cu o matrice care este folosită pentru a separa moleculele, în principal, în funcție de dimensiunea, afinitatea sau încărcarea acesteia.
Ce este cromatografia pe hârtie?
Cromatografia pe hârtie este cel mai simplu tip de cromatografia utilizat și nu este folosită pentru cercetări ample. Este folosit în principal în laboratoarele studenților pentru a identifica biomolecule precum aminoacizii și carbohidrații prezenți în amestecuri. Cromatografia pe hârtie utilizează o fază staționară care este realizată folosind hârtie celulozică sau hârtie de filtru Whatman și o fază mobilă care este de obicei preparată folosind solvenți organici precum n-butanol etc. Faza staționară este saturată cu apă, făcând faza staționară lichidă. Astfel, atunci când compușii sunt reperați și lăsați să curgă în prezența fazei mobile, în funcție de solubilitatea compușilor, aceștia sunt separați. Astfel, la dezvoltarea cromatogramei, se poate face colorare pentru a determina lungimea cursului fiecărui compus. Factorul de retenție poate fi astfel calculat.
Figura 01: Cromatografie pe hârtie
Cromatografia pe hârtie poate fi clasificată în continuare ca cromatografia ascendentă pe hârtie și cromatografia descendentă pe hârtie, în funcție de direcția solventului care rulează.
Ce este cromatografia în strat subțire?
Cromatografia în strat subțire sau TLC este o tehnică utilizată în mod obișnuit pentru a identifica diferiți aminoacizi prezenți într-un amestec sau pentru identificarea proteinelor. Tehnica de separare se bazează pe adsorbția solid-lichid. În timpul cromatografiei în strat subțire, o placă din alumină sau silicagel este utilizată ca fază staționară. Amestecul de solvenți variază în funcție de cerințe și poate utiliza diferite combinații de compuși organici, cum ar fi n-butanol, acid acetic și apă pentru a prepara solventul. Compușii care urmează să fie separați sunt plasați pe placă și scufundați în amestecul de solvenți. Odată ce solventul se deplasează în sus pe baza acțiunii capilare date de placă, compușii reperați pe placă se mișcă și ei în funcție de solubilitatea lor în solvent.
Figura 02: Cromatografie în strat subțire
Detecția petelor după cromatogramă se realizează prin diferite proceduri de colorare. Unii folosesc colorarea cu ninhidrina, care este o metodă destul de toxică de colorare. Cromatogramele moderne în strat subțire folosesc tehnici de fluorescență pentru a vizualiza cromatograma după rulare. În funcție de distanțele pe care le-a parcurs, se poate calcula timpul de retenție al fiecărui compus. Acesta poate fi folosit pentru a identifica tipul de compus separat pe baza amestecului utilizat. TLC este folosit în principal pentru a identifica aminoacizii dintr-un amestec de proteine și, de asemenea, pentru a separa diferite tipuri de monozaharide prezente într-un amestec.
Ce este cromatografia pe coloană?
Cromatografia pe coloană este un termen larg folosit pentru a descrie multe tipuri de tehnici de cromatografie care utilizează metoda de separare pe coloană. În cromatografia pe coloană, o coloană fizică este utilizată cu un material de ambalare pentru a separa compușii. Separarea se poate baza pe diferite proprietăți fizice prezentate de compuși. Aceste proprietăți pot fi încărcarea, dimensiunea, conformația 3D și capacitatea de legare etc. Astfel, coloana ambalată cu materialul matricei acționează ca fază staționară, iar tamponul de spălare aplicat coloanei acționează ca fază mobilă.
Dacă moleculele sunt separate în funcție de dimensiune, materialul de ambalare este împachetat astfel încât să lase pori prin care compușii pot traversa. Astfel, moleculele mai mari care nu pot curge prin pori sunt eluate mai întâi, în timp ce moleculele mai mici necesită mult mai mult timp pentru eluare.
Figura 03: Cromatografia pe coloană
Dacă moleculele sunt separate în funcție de sarcina lor, faza staționară va conține fie un schimbător de anioni, fie un schimbător de cationi către care compușii vor fi atrași în funcție de sarcina lor. Astfel, în timpul etapei de spălare, compușii nelegați vor fi eluați. După adăugarea tamponului de eluare, compușii încărcați legați vor fi eluați. Detectarea acestor eluanți se bazează în principal pe tehnici spectrofotometrice.
Care sunt asemănările dintre stratul subțire de hârtie și cromatografia pe coloană?
- Cromatografie pe coloană și în strat subțire de hârtie pentru separarea biomoleculelor, cum ar fi aminoacizii, proteinele și carbohidrații, sunt utilizate trei tehnici.
- Tehnicile de cromatografie în strat subțire de hârtie și pe coloană au o fază mobilă și o fază staționară.
- Tehnicile de cromatografie în strat subțire de hârtie și pe coloană folosesc mecanisme biofizice pentru separare.
Care este diferența dintre stratul subțire de hârtie și cromatografia pe coloană?
Hârtie vs Strat subțire vs Cromatografie pe coloană |
|
| Cromatografie pe hârtie | Cromatografia pe hârtie este o tehnică cromatografică utilizată pentru a separa compuși pe baza adsorbției lichid-lichid și a solubilității compusului. Utilizează o hârtie de celuloză ca fază staționară. |
| Cromatografie în strat subțire | Cromatografia în strat subțire este o altă tehnică cromatografică bazată pe adsorbția solid-lichid a moleculelor. Are o fază staționară din alumină sau silicagel și un solvent ca fază mobilă, care este solventul. |
| Cromatografie pe coloană | Cromatografia pe coloană folosește o coloană plină cu o matrice care este folosită pentru a separa moleculele, în principal, în funcție de dimensiunea, afinitatea sau încărcarea acesteia. |
| Fază staționară | |
| Cromatografie pe hârtie | Hârtia din nitroceluloză de Whatman este utilizată ca fază staționară în cromatografia pe hârtie. |
| Cromatografie în strat subțire | Alumina sau silicagel sunt folosite ca fază staționară a cromatografiei în strat subțire. |
| Cromatografie pe coloană | În cromatografia pe coloană se folosește ca fază staționară o coloană ambalată cu material de ambalare adecvat. |
| Faza mobilă | |
| Cromatografie pe hârtie | Solventul de rulare este faza mobilă a cromatografiei pe hârtie. |
| Cromatografie în strat subțire | Solventul de rulare este faza mobilă a cromatografiei în strat subțire. |
| Cromatografie pe coloană | Tamponul de spălare este faza mobilă a cromatografiei pe coloană. |
| Mecanisme utilizate pentru separare | |
| Cromatografie pe hârtie | Cromatografia pe hârtie se bazează pe absorbția solid-lichid. |
| Cromatografie în strat subțire | Cromatografia în strat subțire se bazează pe absorbția solid-lichid. |
| Cromatografie pe coloană | Cromatografia pe coloană se bazează pe excluderea dimensiunii, încărcarea și forma. |
| Tampon de eluție | |
| Cromatografie pe hârtie | Nu este cerut de cromatografia pe hârtie. |
| Cromatografie în strat subțire | Nu este necesar pentru cromatografia în strat subțire. |
| Cromatografie pe coloană | Necesar în cromatografia pe coloană. |
| Detecție | |
| Cromatografie pe hârtie | Cotare și prin determinarea factorului de retenție. |
| Cromatografie în strat subțire | Cotare și prin determinarea factorului de retenție. |
| Cromatografie pe coloană | Determinare spectrofotometrică. |
Rezumat – Strat subțire de hârtie vs cromatografie pe coloană
Cromatografia pe hârtie, TLC și cromatografia pe coloană sunt tehnici de separare utilizate pentru a separa biomolecule precum proteinele, aminoacizii și carbohidrații (în principal monozaharide). Cromatografia pe hârtie folosește o hârtie de celuloză ca fază staționară, iar mecanismul de separare se bazează pe adsorbția solid-lichid. TLC folosește și mecanisme de adsorbție solid-lichid. Moleculele sunt separate pe faza staționară, în funcție de solubilitatea lor în faza mobilă. Cromatografia pe coloană utilizează proprietăți fizice cum ar fi dimensiunea, forma, sarcina și greutatea moleculară a compusului pentru a se separa. Coloana plină cu materialul matricei acționează ca fază staționară, în timp ce tamponul de spălare acționează ca fază de solvent. Aceasta este diferența dintre un strat subțire de hârtie și cromatografia pe coloană.
