Diferența cheie – Nick Translation vs Primer Extension
Translația Nick și extensia primerului sunt două tehnici importante efectuate în biologia moleculară. Diferența esențială dintre translația nick-ului și extensia primerului este că procesul de translație nick produce sonde marcate pentru alte tehnici de hibridizare, în timp ce metoda extensiei primerului identifică o secvență specifică de ARN dintr-un amestec și dezvăluie informații despre expresia ARNm. Ambele tehnici au o mare importanță și sunt efectuate în mod obișnuit în laboratoarele de cercetare moleculară.
Ce este Nick Translation?
Translatarea Nick este o tehnică importantă folosită pentru a pregăti sonde marcate pentru diferite tehnici de biologie moleculară, cum ar fi blotting, hibridizare in situ, hibridizare fluorescentă in situ etc. Este o metodă in vitro de etichetare a ADN-ului. Sondele ADN sunt utilizate pentru a identifica secvențe specifice de ADN sau ARN. Cu ajutorul unei sonde marcate, fragmente specifice pot fi marcate sau vizualizate dintr-un amestec complex de acid nucleic. Prin urmare, sondele marcate sunt preparate folosind diferite tehnici pentru a fi utilizate pentru diferite tehnici. Translația Nick este o astfel de metodă care produce sonde marcate cu ajutorul enzimelor ADN-a 1 și ADN-polimeraza 1.
Procesul de translație a poreclei începe cu activitatea enzimei ADNază 1. ADNaza 1 introduce spărturi în coloana vertebrală de fosfat a ADN-ului dublu catenar prin scindarea legăturilor fosfodiesterice dintre nucleotide. Odată ce nick-ul este creat, gruparea 3’ OH liberă a nucleotidei va fi obținută și enzima ADN polimeraza 1 va acționa asupra ei. Activitatea exonucleazei 5’ până la 3’ a ADN-polimerazei 1 îndepărtează nucleotidele din nick spre direcția 3’ a catenei de ADN. Simultan, activitatea polimerazei enzimei ADN polimeraza 1 funcționează și adaugă nucleotide pentru a înlocui nucleotidele îndepărtate. Dacă nucleotidele au fost marcate, înlocuirea va avea loc cu nucleotidele marcate și va marca ADN-ul pentru identificare. Acest ADN marcat nou sintetizat poate fi folosit ca sonde în diferite reacții de hibridizare în Biologie Moleculară.
Figura 01: Procesul de traducere a Nick
Ce este Primer Extension?
Extensia primerului este o tehnică care este utilizată pentru a găsi o secvență specifică de ARN dintr-un amestec de ARN și pentru a localiza capătul 5’ al transcriptului ARNm. De asemenea, este folosit pentru a studia structura ARN-ului și expresia. Metoda de extensie a primerului se realizează cu primeri marcați sau cu nucleotide marcate. Dacă se folosesc primeri marcați, exclude necesitatea etichetării nucleotidelor care sunt utilizate pentru sinteza cADN-ului. Există mai mulți pași în această tehnică. Începe cu extragerea ARN-ului din probă. Apoi se adaugă la amestec un primer oligonucleotidic marcat împreună cu ingredientele necesare pentru a sintetiza ADNc dintr-o secvență specifică de ARN. Primer se recoace cu secvența complementară din amestec. Folosind secvența de coacere a primerului ca matriță, enzima transcriptaza inversă sintetizează ADN-ul complementar (ADNc) al secvenței de ARN. Recoacere primer și transcripție inversă apar numai atunci când secvența specifică de ARN este prezentă în probă. În cele din urmă, atunci când se efectuează electroforeza pe gel de denaturare, poate fi determinată dimensiunea secvenței de ARN. De asemenea, este ușor să găsiți baza +1 a secvenței ARNm (situs de inițiere a transcripției) prin metoda extensiei primerului. Cantitatea de ARNm prezentă în probă poate fi cuantificată prin această metodă dacă se folosește un exces de primer.
Figura 02: Extensie de grund
Care este diferența dintre Nick Translation și Primer Extension?
Nick Translation vs Primer Extension |
|
| Translatarea Nick este un proces care creează sonde ADN marcate pentru diferite reacții de hibridizare. | Extensia primerului este o tehnică folosită pentru a găsi un anumit ARN sau pentru a studia expresia genelor. |
| enzime utilizate | |
| Se folosesc DNaza 1 și enzimele ADN polimerază. | Se folosește enzima transcriptază inversă. |
| Importanță | |
| Traducerea Nick facilitează marcarea unei anumite secvențe ADN. | Extensia Primer permite detectarea unei anumite dimensiuni a secvenței de ARNm și a cantității prezente în probă. |
Rezumat – Nick Translation vs Primer Extension
Translatarea Nick este o metodă utilizată pentru a sintetiza sonde marcate pe baza activităților enzimelor ADN-polimerazei 1 ADN-azei 1 și E coli. Este o metodă in vitro folosită în laboratoare înainte de diferite tehnici de hibridizare. În timpul translației nick-ului, activitatea exonucleazei 5’-3’ a ADN polimerazei 1 îndepărtează nucleotidele înaintea nick-ului, iar activitatea polimerazei ADN-polimerazei 1 înlocuiește nucleotidele îndepărtate cu nucleotide marcate în spatele nick-ului. Extensia primerului este o metodă care este utilizată pentru a detecta un anumit transcript de ARN dintr-un amestec și pentru a cuantifica dimensiunea și cantitatea de ARN de interes. Aceasta este diferența dintre traducerea poreclei și extensia primerului.
