Diferența cheie dintre Golden Gate și Gibson Assembly este că Golden Gate se bazează pe prezența site-urilor de restricție într-o anumită secvență pentru a fi clonată, în timp ce Gibson Assembly nu se bazează pe prezența site-urilor de restricție într-o anumită secvență pentru fi clonat.
În ultimele decenii, oamenii de știință moleculari au dezvoltat diverse proceduri standardizate care permit asamblarea mai ușoară a mai multor fragmente de ADN într-o singură piesă. Prin urmare, metodele de clonare precum Ligarea Enzimelor de Restricție, Clonarea Gateway, Asamblarea Gibson, Asamblarea Golden Gate și Clonarea TOPO sunt utilizate pe scară largă de către cercetători în experimentele științifice. Prin urmare, Golden Gate și Gibson Assembly sunt două metode de clonare moleculară care permit asamblarea mai multor fragmente de ADN într-o singură bucată.
Ce este Golden Gate Assembly?
Golden Gate este o metodă de clonare moleculară care facilitează asamblarea mai multor fragmente de ADN într-o singură bucată. Această metodă se bazează pe prezența situsurilor de restricție într-o anumită secvență care urmează să fie donată. A apărut în 1996. Această tehnică folosește enzime de restricție de tip IIS și ADN ligaza T4. Aceste enzime taie ADN-ul în afara locurilor de recunoaștere. Ele pot crea protuberanțe non-palindromice. Prin urmare, mai multe fragmente de ADN pot fi asamblate folosind combinații de secvențe superioare.
Figura 01: Golden Gate
Procedura de asamblare Golden Gate
Tehnica Golden Gate are trei pași principali în procedura sa:
- crearea de supraîncărcări în vectorul de clonare,
- ansamblu de mai multe inserții de ADN prin utilizarea secvențelor specifice fragmentelor în proeminențe și
- ligare.
Ansamblul Golden Gate folosește vectori circulari de clonare (vector de destinație). Mai mult, în această metodă, locul de restricție este eliminat din produsul legat pentru a efectua digestia și ligatura simultan. Un protocol tipic de ciclu termic pentru Golden Gate oscilează între 37 °C și 16 °C, deoarece 37 °C este optim pentru enzimele de restricție și 16 °C este optim pentru ligaze.
Ce este Gibson Assembly?
Gibson Assembly este o metodă de clonare moleculară care permite asamblarea mai multor fragmente de ADN într-o singură bucată. Spre deosebire de metoda Golden Gate, această metodă nu se bazează pe prezența site-urilor de restricție într-o anumită secvență care urmează să fie donată. A fost găsit de Daniel G. Gibson de la Institutul J. Craig Venter. Această tehnică este un tip de metodă de clonare independentă de secvență și ligază (SLIC).
Figura 02: Ansamblul Gibson
Procedura de asamblare Gibson
Gibson Assembly are nevoie de fragmente de ADN care conțin 20-40 de perechi de baze care se suprapun cu fragmente de ADN adiacente. Suprapunerile sunt adăugate prin PCR. Apoi aceste fragmente de ADN sunt adăugate la amestecul Gibson Maser care are trei enzime. Această procedură este efectuată în condiții izoterme (50 °C timp de 1 oră) folosind trei enzime diferite: exonuclează, ADN polimerază și ADN ligază. Exonucleaza mestecă înapoi ADN-ul de la capătul 5’. Astfel, nu inhibă activitatea polimerazei și permite reacției să continue într-un singur proces. Regiunile monocatenar rezultate de pe fragmentele de ADN adiacente pot fi recoapte datorită secvențelor suprapuse. ADN polimeraza umple golurile prin adăugarea de nucleotide. În cele din urmă, ADN-ligaza se unește covalent cu ADN-ul segmentelor adiacente. În mod normal, Gibson Assembly folosește vectori de destinație linializați. În plus, această metodă poate combina simultan până la 15 fragmente de ADN pe baza asemănării secvenței.
Asemănări între Golden Gate și Gibson Assembly
- Golden Gate și Gibson Assembly sunt două metode de clonare moleculară.
- Ambele metode pot asambla mai multe fragmente de ADN într-o singură bucată.
- Aceste metode folosesc vectori de destinație.
- Ambele metode folosesc termocicloare pentru asamblarea mai multor fragmente de ADN.
- Sunt utilizați în mutageneza dirijată pe site.
Diferența dintre Golden Gate și Gibson Assembly
Golden Gate este o metodă de clonare moleculară utilizată în asamblarea mai multor fragmente de ADN într-o singură bucată, bazându-se pe prezența site-urilor de restricție într-o anumită secvență care urmează să fie donată, în timp ce Gibson Assembly este o metodă de clonare moleculară utilizată în asamblarea mai multor fragmente de ADN într-o singură bucată fără a se baza pe prezența situsurilor de restricție într-o anumită secvență care urmează să fie donată. Aceasta este diferența cheie dintre Golden Gate și Gibson Assembly. În plus, metoda Golden Gate utilizează un vector de destinație circular, în timp ce metoda Gibson Assembly folosește un vector de destinații liniarizat.
Următorul infografic prezintă diferența dintre Golden Gate și Gibson Assembly.
Rezumat – Golden Gate vs Gibson Assembly
Clonarea moleculară este o metodă folosită pentru a asambla molecule de ADN recombinat și a direcționa replicarea acestora în organismele gazdă. Golden Gate și Gibson Assembly sunt două metode de clonare moleculară care permit asamblarea mai multor fragmente de ADN într-o singură bucată. Metoda Golden Gate se bazează pe prezența site-urilor de restricție într-o anumită secvență care urmează să fie donată, în timp ce Gibson Assembly nu se bazează pe prezența site-urilor de restricție într-o anumită secvență care urmează să fie donată. Astfel, aceasta este diferența cheie dintre Golden Gate și Gibson Assembly.
