Diferența cheie – Microarray vs secvențierea ARN
Transcriptomul reprezintă întregul conținut de ARN prezent într-o celulă, incluzând ARNm, ARNr, ARNt, ARN degradat și ARN nedegradat. Profilarea transcriptomului este un proces important pentru a înțelege informațiile celulare. Există mai multe metode avansate pentru profilarea transcriptomului. Microarray și secvențierea ARN sunt două tipuri de tehnologii dezvoltate pentru analiza transcriptomului. Diferența cheie între microarray și secvențierea ARN este că microarray se bazează pe potențialul de hibridizare al sondelor marcate preproiectate cu secvențe de ADNc țintă, în timp ce secvențierea ARN se bazează pe secvențierea directă a catenelor de ADNc prin tehnici avansate de secvențiere, cum ar fi NGS. Micromatrice este realizată cu cunoștințele anterioare despre secvențe, iar secvențierea ARN este efectuată fără cunoștințele anterioare despre secvențe.
Ce este Microarray?
Microarray este o metodă robustă, fiabilă și de mare capacitate utilizată pentru profilarea transcriptomului de către oamenii de știință. Este cea mai populară abordare pentru analiza transcripției. Este o metodă cu costuri reduse, care depinde de sondele de hibridizare.
Tehnica începe cu extracția ARNm din probă și construirea bibliotecii de ADNc din ARN total. Apoi este amestecat cu sonde preproiectate marcate fluorescent pe o suprafață solidă (matrice spot). Secvențele complementare hibridizează cu sondele marcate din microarray. Apoi microarray este spălat și ecranat, iar imaginea este cuantificată. Datele adunate trebuie analizate pentru a obține profilurile de expresie relative.
Intensitatea sondelor cu microarray se presupune a fi proporțională cu cantitatea de transcrieri din probă. Cu toate acestea, acuratețea tehnicii depinde de sondele proiectate, de cunoștințele anterioare ale secvenței și de afinitatea sondelor pentru hibridizare. Prin urmare, tehnologia microarray are limitări. Tehnica microarray nu poate fi efectuată cu transcrieri cu abundență scăzută. Nu reușește să diferențieze izoformele și să identifice variante genetice. Deoarece această metodă depinde de hibridizarea sondelor, unele probleme legate de hibridizare, cum ar fi hibridizarea încrucișată, hibridizarea nespecifică etc. apar în tehnica microarray.
Figura 01: Microarray
Ce este secvențierea ARN?
Secvențierea ARN shotgun (ARN seq) este o tehnică recent dezvoltată de secvențiere a întregului transcriptom. Este o metodă rapidă și cu randament ridicat de profilare a transcriptomului. Cuantifică direct expresia genelor și are ca rezultat investigarea profundă a transcriptomului. Secv. ARN nu depinde de sondele preproiectate sau de cunoștințele anterioare ale secvențelor. Prin urmare, metoda ARN seq are o sensibilitate ridicată și capacitatea de a detecta noi gene și variante genetice.
Metoda de secvențiere a ARN este realizată prin mai mulți pași. ARN-ul total al celulei trebuie izolat și fragmentat. Apoi, folosind transcriptaza inversă, trebuie pregătită o bibliotecă de ADNc. Fiecare catenă de ADNc trebuie legată cu adaptori. Apoi fragmentele legate trebuie amplificate și purificate. În cele din urmă, folosind o metodă NGS, trebuie efectuată secvențierea ADNc.
Figura 02: Secvențierea ARN
Care este diferența dintre microarray și secvențierea ARN?
Microarray vs secvențierea ARN |
|
| Microarray este o metodă robustă, fiabilă, cu randament ridicat. | Secvențierea ARN este o metodă precisă și cu randament ridicat. |
| Cost | |
| Aceasta este o metodă cu costuri reduse. | Aceasta este o metodă costisitoare. |
| Analiza unui număr mare de mostre | |
| Acest lucru facilitează analiza unui număr mare de mostre simultan. | Acest lucru facilitează analiza unui număr mare de mostre. |
| Analiza datelor | |
| Analiza datelor este complexă. | Se generează mai multe date în această metodă; prin urmare, procesul este mai complex. |
| Cunoașterea anterioară a secvențelor | |
| Această metodă se bazează pe sonde de hibridizare, deci sunt necesare cunoștințe prealabile despre secvențe. | Această metodă nu depinde de cunoștințele anterioare ale secvenței. |
| Variații structurale și gene noi | |
| Această metodă nu poate detecta variații structurale și gene noi. | Această metodă poate detecta variații structurale, cum ar fi fuziunea genelor, splicing alternativ și gene noi. |
| Sensibilitate | |
| Acest lucru nu poate detecta diferențele de exprimare a izoformelor, deci are o sensibilitate limitată. | Acest lucru are o sensibilitate ridicată. |
| Rezultat | |
| Acest lucru poate duce doar la niveluri relative de expresie. Acest lucru nu oferă o cuantificare absolută a expresiei genelor. | Oferă niveluri de expresie absolute și relative. |
| Reanalizarea datelor | |
| Acest lucru trebuie reluat pentru a putea reanaliza. | Datele de secvențiere pot fi reanalizate. |
| Nevoia de personal și infrastructură specifică | |
| Infrastructura și personalul specific nu sunt necesare pentru microarray. | Infrastructură și personal specifice necesare pentru secvențierea ARN. |
| Probleme tehnice | |
| Tehnica microarray are probleme tehnice, cum ar fi hibridizarea încrucișată, hibridizarea nespecifică, rata limitată de detecție a sondelor individuale etc. | Tehnica ARN seq evită probleme tehnice, cum ar fi hibridizarea încrucișată, hibridizarea nespecifică, rata limitată de detecție a sondelor individuale etc. |
| Prejudecăți | |
| Aceasta este o metodă părtinitoare, deoarece depinde de hibridizare. | Bias este scăzut în comparație cu microarray. |
Rezumat – Microarray vs secvențierea ARN
Microarray și metodele de secvențiere ARN sunt platforme de mare capacitate dezvoltate pentru profilarea transcriptomului. Ambele metode produc rezultate care sunt foarte corelate cu profilurile de expresie a genelor. Cu toate acestea, secvențierea ARN are avantaje față de microarray pentru analiza expresiei genelor. Secvențierea ARN este o metodă mai sensibilă pentru detectarea transcriptelor cu abundență scăzută decât microarray. Secvențierea ARN permite, de asemenea, diferențierea între izoforme și identificarea variantelor de gene. Cu toate acestea, microarray este alegerea comună a majorității cercetătorilor, deoarece secvențierea ARN este o tehnică nouă și costisitoare, cu provocări de stocare a datelor și analiză complexă a datelor.
