Diferența cheie – Primeri PCR vs Primerii de secvențiere
Odată cu evoluțiile recente din domeniul biologiei moleculare, au fost dezvoltate diferite tehnici genetice care au făcut ca procesele de investigare a diferitelor căi ale subiectului să fie ușor și precise. PCR și alte proceduri de secvențiere sunt două astfel de tehnici importante. Ele folosesc diferite subcomponente. Primerii sunt considerați ca subcomponenta majoră comună atât tehnicilor PCR, cât și tehnicilor de secvențiere. Primerii PCR sunt utilizați pentru amplificarea unei anumite secvențe de ADN, în timp ce primerii de secvențiere sunt utilizați în contextul secvențierii unui fragment de ADN cu intenția de a dezvălui ordinea sa specifică a secvenței de nucleotide. Aceasta este diferența cheie dintre primerii PCR și primerii de secvențiere.
Ce sunt primerii PCR?
Reacția în lanț a polimerazei (PCR) este o tehnică genetică care este utilizată în domeniul biologiei moleculare pentru a amplifica o singură sau câteva copii ale unui anumit segment de ADN și pentru a obține multe milioane de copii identice. Într-o reacție PCR, sunt utilizate diferite componente, inclusiv primeri. Primerii sunt catene scurte de ADN cu o lungime a nucleotidelor de 18-25 făcându-le compatibili cu regiunea de început și de sfârșit a fragmentelor de ADN care urmează să fie amplificate. Primerii pot fi un primer direct și un primer invers. Acești primeri se leagă de fragmentul de ADN în punctele specifice în care face ca ADN polimeraza să se lege de primerul specific din locație și inițiază sinteza noii catene de ADN.
Selecția primerilor este un aspect important al procesului PCR. Selectarea lungimii grundului este importantă. Lungimea ideală ar fi de 18-25 de nucleotide. Dacă lungimea este prea scurtă sau prea mare, primerii nu se vor lega de secvența de ADN pentru a fi amplificată cu precizie. Primerii care au lungime prea scurtă duc la recoacere nespecifică a primerului în diferite locații ale secvenței ADN.
Figura 01: Primeri PCR
Conținutul de guanină și citozină (GC) dintr-un primer bun ar trebui să fie în intervalul 40-60. Temperatura de recoacere a primerului și temperatura de topire sunt factori vitali în timpul PCR. Temperatura de topire trebuie calculată cu precizie, iar temperatura de recoacere a amorsei trebuie să fie cu 5 0C mai mică decât temperatura de topire. Temperatura de topire trebuie să fie de 60 °C și 75 °C. Temperaturile prea ridicate sau prea scăzute vor duce la o activitate mai puțin activă a ADN polimerazei.
Ce sunt amorsele de secvențiere?
Primii de secvențiere sunt utilizați în contextul secvențierii unui fragment de ADN cu intenția de a dezvălui identitatea sa specifică. Pentru a obține rezultate bune de secvențiere, primeri și șabloane de în altă calitate sunt importante. Astfel, atunci când primerii sunt selectați, aceștia ar trebui să fie unici pentru o anumită regiune în care dorim să o secvențăm. De asemenea, ar trebui să fie cu o orientare corectă în cazul în care secvențele sunt de obicei generate de la capetele 3’ până la 5’ ale primerilor. Secvența ar trebui să lipsească de auto-hibridare nedorită, cum ar fi formarea de bucle de ac de păr. Nu trebuie să conțină formarea consecutivă de baze de guanină.
Temperatura de topire (Tm) a amorsei trebuie să fie adecvată pentru condițiile de secvențiere. Prin urmare, ar trebui să se situeze între 52oC și 74oC. Prepararea oligonucleotidelor pentru a fi utilizate ca primer ar trebui să fie purificată pentru a obține lungimea completă dorită a secvenței. Dacă oligonucleotidele conțin impurități, semnalizarea secvenței primerului va fi suprapusă de la diferite situsuri de amorsare și, de asemenea, va scădea numărul de celule de bază.
Figura 02: Primerii de secvențiere
Temperatura de topire a primerului (Tm) a unei oligonucleotide determină cât de puternice sunt hibridizate catenele complementare de ADN între ele. Tm poate fi considerat ca un calcul termodinamic în care depinde atât de secvențele de ADN, cât și de mai multe condiții, cum ar fi concentrația de sare. Tm este importantă în timpul PCR, unde o variantă numită secvențiere ciclului este utilizată pentru a produce un grup de fragmente terminate cu dideoxinucleotide. Aici, primerul care este secvențiat va fi inițial recoacere alternativ, apoi extins și în sfârșit denaturat pentru amplificare. Prin urmare, valoarea Tm ar trebui să fie între 52oC și 74o C. Oligonucleotidele sintetizate pot fi obținute de la laboratoarele de sinteză ADN/ARN conform alegere. Scara mică de sinteză care este utilizată pentru secvențierea ADN-ului este de obicei de 50 nmol. De asemenea, cel mai important, primerii utilizați pentru secvențiere ar trebui să fie purificați pentru a nu conține impurități care vor preveni reducerea calității.
Care sunt asemănările dintre primerii PCR și primerii de secvențiere?
- Atât primerii PCR, cât și primerii de secvențiere sunt primeri care sunt utilizați în procesul de amplificare a unei secvențe ADN țintite.
- Atât primerii PCR, cât și primerii de secvențiere sunt formați din nucleotide.
- Atât primerii PCR, cât și primerii de secvențiere sunt oligomeri scurti.
Care este diferența dintre primerii PCR și primerii de secvențiere?
Primeri PCR versus primeri de secvențiere |
|
| Primerii PCR sunt catene scurte de ADN cu o lungime a secvenței de nucleotide de 18-25 făcându-le compatibili cu regiunea de început și de sfârșit a fragmentelor de ADN care urmează să fie amplificate. | Primii de secvențiere sunt oligomeri scurti care sunt utilizați în contextul secvențierii unui fragment de ADN cu intenția de a-i dezvălui identitatea specifică. |
| Funcție | |
| Primerii PCR sunt utilizați pentru amplificarea unei anumite secvențe de ADN. | Primii de secvențiere sunt utilizați în contextul secvențierii unui fragment de ADN cu intenția de a-i dezvălui identitatea specifică. |
| Numărul de grunduri necesare | |
| Două grunduri; un primer direct și un primer invers sunt utilizați ca primeri PCR. | Este nevoie de un singur primer ca primer de secvențiere. |
Rezumat – Primeri PCR vs Primerii de secvențiere
Primii de secvențiere sunt utilizați în contextul secvențierii unui fragment de ADN cu intenția de a dezvălui identitatea sa specifică. Un primer de secvențiere va fi suficient pentru a rula procesul. Pentru a obține rezultate bune de secvențiere, primeri și șabloane de în altă calitate sunt importante. Astfel, atunci când sunt selectați primeri, aceștia ar trebui să fie unici pentru o anumită regiune în care dorim să o secvențăm. Primerii PCR sunt catene scurte de ADN cu o lungime de nucleotidă de 18-25, care este compatibilă cu regiunea de început și de sfârșit a fragmentelor de ADN care urmează să fie amplificate. Primerii PCR pot fi un primer direct și un primer invers. Conținutul de guanină și citozină (GC) într-un primer bun ar trebui să fie în intervalul 40-60. Temperatura de recoacere a primerului și temperatura de topire sunt aspecte vitale în timpul PCR. Aceasta este diferența dintre primerii PCR și primerii de secvențiere.
