Diferența cheie – Clonarea vs Subclonarea
Clonarea și subclonarea sunt proceduri biologice moleculare care creează celule sau organisme identice din punct de vedere genetic care poartă ADN-ul sau gena care sunt de interes. Clonarea este o tehnică care implică inserarea genei sau ADN-ului interesat într-un vector, replicarea acesteia într-o bacterie gazdă și producerea de celule sau organisme care sunt copii exacte ale structurii genetice. Subclonarea este o tehnică care implică inserarea genei de interes, care este deja inserată într-un vector, într-un vector secundar, replicarea acesteia în cadrul unei bacterii gazdă și producerea de copii identice genetic ale celulelor sau organismelor. Diferența cheie între clonare și subclonare este că, în clonare, gena de interes, odată legată într-un vector, continuă procesul de donare, în timp ce, în subclonare, gena de interes deja donată este separată de vectorul părinte și inserată din nou în un vector destinatar și continuați procesul.
Ce este clonarea?
Clonarea este procedura care produce organisme sau celule identice genetic. În natură, clonarea are loc prin mijloace de reproducere asexuată. Atunci când nu există nicio recombinare sau modificare genetică, celulele fiice primesc aceeași componență genetică a părintelui. Organismele procariote și eucariote creează clone prin fisiune binară, înmugurire, mitoză etc. În biologia moleculară, clonarea genelor sau a fragmentelor specifice de ADN este o metodă populară de a studia structura și funcția acelei secțiuni de ADN.
Obiectivul principal al clonării moleculare este de a face milioane de copii ale celulelor sau organismelor identice genetic care poartă fragmentul de ADN de interes (în principal gene). Ea creează organisme cu copii genetice exacte ale altuia. În primul rând, genele specifice sunt donate în studii moleculare pentru a obține informații structurale și funcționale și pentru secvențierea ADN-ului. De asemenea, pentru producerea de proteine sau produse specifice la scară largă, clonarea este utilizată pe scară largă.
Procedura de clonare
Pașii de bază ai procedurii de clonare sunt următorii.
- Identificarea și izolarea genei de interes. (Amplificarea genei de interes prin PCR).
- Digestia de restricție a genei de interes (endonucleaza de restricție a tăiat gena).
- Digestia de restricție a vectorului ADN. (ADN-ul vectorial este de asemenea tăiat folosind aceeași endonuclează de restricție).
- Inserarea genei în vector și formarea moleculei recombinante.
- Transformarea vectorului recombinant într-o bacterie gazdă.
- Izolarea și identificarea bacteriilor transformate (vectorul plasmid ar trebui să conțină o genă selectabilă, cel mai frecvent o genă de rezistență la antibiotice pentru screeningul bacteriilor transformate).
- Expresia genică recombinantă în cadrul gazdei.
Figura_01: Procedura de clonare
Ce este subclonarea?
Subclonarea este o procedură de mutare a unei gene de interes de la un vector la altul pentru a vedea expresia genei pentru a obține funcționalitatea dorită a genei. În această metodă sunt implicați doi vectori; și anume, vector părinte și vector destinație. Inserțiile clonate sunt mutate din nou într-un al doilea vector în subclonare. Obiectivul transferului genei de la primul vector la al doilea vector este de a obține ceva ce nu ar putea fi făcut de primul vector sau de a separa din nou o genă în fragmentul de ADN deja donat și de a o exprima singur. Enzimele de restricție sunt utilizate în această procedură la început.
Procedura de subclolare
Pașii de bază ai subclonării sunt următorii.
- Cu ajutorul endonucleazelor de restricție, separarea ADN-ului de interes în plasmida donor (vector părinte).
- Amplificarea ADN-ului de interes folosind PCR.
- Purificarea produsului PCR (ADN de interes) prin electroforeză pe gel.
- Deschiderea plasmidei primitoare de către aceleași endonucleaze de restricție utilizate pentru a separa ADN-ul de interes în plasmida părinte.
- Ligarea ADN-ului de interes (genă) în plasmida receptoare pentru a crea plasmida subclonată.
- Transformarea vectorului subclonat într-o bacterie gazdă competentă.
- Depistarea celulelor transformate.
- Purificarea ADN-ului plasmid și utilizarea pentru secvențierea ADN-ului sau exprimarea genelor pentru a obține produsele dorite.
Subclonarea este efectuată cu ocazia izolării unei gene din grupul clonat de gene sau atunci când gena de interes este necesară transferarea într-o plasmidă utilă pentru a vedea funcția exactă a genei de interes.
Figura_02: Procedura de subclonare
Care este diferența dintre clonare și subclonare?
Clonare vs subclonare |
|
| Clonarea este procedura care produce organisme sau celule identice genetic. | Subclonarea este o procedură de mutare a unei gene de interes de la un vector la altul pentru a vedea expresia genei pentru a obține funcționalitatea dorită a genei. |
| Proces | |
| Separați ADN-ul de interes de organism și introdus într-un vector o dată și clonat | ADN-ul deja clonat este separat de primul vector și inserat într-un al doilea vector și clonat. |
| Inserați mișcare prin vectori | |
| Nu mută inserțiile (ADN de interes) de la un vector la altul. | Mutați inserțiile din vectorul părinte în vectorul destinație. |
Rezumat – Clonarea vs Subclonarea
Clonarea creează celule sau organisme identice genetic cu gena inserată sau ADN-ul de interes. Se realizează prin separarea și inserarea ADN-ului de interes într-un vector și expresie în cadrul unei bacterii gazdă. Subclonarea împărtășește pași similari cu clonarea. Cu toate acestea, în subclonare, fragmentul de ADN deja donat (gena de interes) este inserat într-un vector și transformat într-o bacterie gazdă. Aceasta este diferența cheie dintre clonare și subclonare.
