Diferența cheie – Tripsinizare la cald vs la rece
Tripsinizarea la cald și la rece sunt două metode utilizate în dezagregarea enzimatică a celulelor în cultura de celule animale. Diferența cheie dintre tripsinizarea caldă și cea rece, așa cum sugerează numele, depinde de temperatura la care este adăugată tripsina pentru dezagregarea celulară. Tripsinizarea la cald are loc în condiții de temperatură mai ridicată (36,5 – 37 0C), în timp ce tripsinizarea la rece are loc în condiții de temperatură scăzută.
În timpul procesului de cultivare a celulelor primare a celulelor animale, există trei metode principale utilizate și s-au dovedit a fi de succes. Cele trei metode includ dezagregarea mecanică a celulelor, dezagregarea enzimatică a celulelor și tehnica de explant primar. Dezagregarea enzimatică a celulelor duce la izolarea celulelor și se face de către enzima de degradare a proteinelor tripsina. Prin urmare, acest proces este cunoscut sub numele de tripsinizare. Tripsinizarea se poate face în două condiții diferite și anume tripsinizare caldă și tripsinizare la rece. Tripsinizarea la cald este metoda de tratare a celulelor cu tripsină în condiții calde la o temperatură de 36,5 – 37 0C. Tripsinizarea la rece este procesul de tratare cu tripsină care are loc în condiții mai reci, de preferință în gheață, menținând temperaturi foarte scăzute.
Ce este tripsinizarea caldă?
Tripsinizarea poate fi făcută pentru a dezagrega componentele celulare pentru a izola celulele pentru a produce o cultură de celule primare. Tripsina este o enzimă de degradare a proteinei, iar amestecul de enzime utilizat în tripsinizare poate fi fie un extract brut, fie un produs purificat. Se spune că extractul brut este mai eficient în liza proteinelor și în dezintegrarea celulelor, deoarece conține alte enzime degradative.
Tripsinizarea la cald este metoda enzimatică cel mai frecvent utilizată pentru dezagregarea celulelor care are loc în condiții de temperatură mai ridicată. Înainte de tratamentul prin tripsinizare, țesutul dorit este tăiat în bucăți mai mici. Facilitează procesul ușor de dezagregare. Țesutul tocat este apoi spălat într-un mediu special cunoscut sub numele de mediu de sare bazală de disecție.
La terminarea etapei de spălare, celulele sunt transformate într-un balon care conține enzima activă, care este tripsina. Deoarece această tehnică implică un protocol de tripsinizare caldă, tripsina este plasată la o temperatură de aproximativ 37 0C timp de aproximativ patru ore.
Figura 01: Tripsina
Conținutul este amestecat și agitat prin utilizarea metodelor de centrifugare pentru ușurința protocolului și pentru a accelera procesul de dezagregare. Odată ce timpul recomandat este atins, celulele pot fi derivate din supernatant. Celulele derivate din supernatant sunt apoi incubate la o anumită temperatură și timp.
Ce este tripsinizarea la rece?
Tripsinizarea la rece este celăl alt tip de tripsinizare care are loc în condiții de frig. În această tehnică, celulele care sunt tăiate și spălate sunt plasate în flacoane pe gheață și apoi înmuiate cu tripsină. Perioada de înmuiere este mult mai lungă – aproximativ 6 – 24 de ore.
După finalizarea procedurii de înmuiere, tripsina este îndepărtată din lizatul celular, iar bucățile de țesut sunt incubate în continuare la 37 0C timp de aproximativ 20 – 30 de minute. Dezagregarea celulelor este realizată prin pipetarea repetată a amestecului de țesuturi. Acest lucru va permite celulelor să se disocieze de membrană și să ajungă la supernatant. Odată ce celulele sunt în supernatant, ele sunt incubate și crescute la o temperatură și o perioadă de timp dorite.
Metoda de tripsinizare la rece are mai multe avantaje
- Randament mai mare de celule viabile, deoarece deteriorarea celulelor este minimizată. Deteriorarea celulelor este redusă la minimum prin neutilizarea pașilor de centrifugare.
- Metoda foarte convenabilă.
- Mai puțin laborios.
Principala limitare a metodei de tripsinizare la rece este că cantitățile mari nu pot fi utilizate într-un singur caz.
Care sunt asemănările dintre tripsinizarea caldă și cea rece?
- Atât procesele de tripsinizare la cald, cât și la rece folosesc enzima tripsina pentru dezagregarea celulelor.
- Atât procesele de tripsinizare la cald, cât și la rece sunt utilizate în procedurile de cultură celulară pentru dezagregarea celulelor.
- În procedurile de tratament cu tripsinizare la cald și la rece, celulele sunt derivate din supernatant.
Care este diferența dintre tripsinizarea la cald și la rece?
Tripsinizare la cald vs la rece |
|
| Tripsinizarea la cald este metoda de tratare a celulelor cu tripsină în condiții calde la o temperatură de 36,5 – 37 0. | Tripsinizarea la rece este procesul de tratare cu tripsină care are loc în condiții mai reci, de preferință în gheață, menținând temperaturi foarte scăzute. |
| Protocol | |
| Bucățile de țesut tăiate sunt menținute la 37 0C continuu pe tot parcursul procedurii. | Bucățile de țesut tocat sunt menținute inițial la temperaturi de gheață și apoi menținute la 37 0. |
| Temperatura | |
| Tripsinizarea caldă are loc la 36,5 – 37 0 | Tripsinizarea la rece are loc la temperaturi de gheață. |
| Timp consumat | |
| Timp mai mic necesar pentru întregul proces (aproximativ 4 ore) de tripsinizare caldă. | Timp mai lung necesar (aproximativ 6 – 24 de ore) pentru tripsinizarea la rece. |
| Randamentul celulelor viabile | |
| Scăzut în tripsinizare caldă. | Ridicat în tripsinizare la rece. |
| Utilizarea centrifugării | |
| Centrifugarea este necesară pentru dezagregarea celulelor în tripsinizare caldă. | Centrifugarea nu este necesară în tripsinizarea la rece. |
| Cantitatea inițială de țesut pentru tripsinizare | |
| O cantitate mai mare de țesut poate fi utilizată în tripsinizarea caldă. | O cantitate mai mică de țesut poate fi utilizată în tripsinizarea la rece. |
| Daune celulare | |
| Ridicat din cauza centrifugării în tripsinizare caldă. | Mai puțin din cauza tripsinizării la rece. |
Rezumat – Tripsinizare la cald vs la rece
Tripsinizarea este metoda de utilizare a enzimei de degradare a proteinei tripsina pentru dezagregarea și prepararea culturilor de celule primare în timpul procesului de cultivare a celulelor. Există două tehnici principale de tripsinizare bazate pe temperaturile utilizate în timpul procedurii. Sunt tripsinizare caldă și rece. Tripsinizarea la cald este efectuată la 37 0C în timp ce tripsinizarea la rece este efectuată în condiţii de gheaţă. Deși tripsinizarea la rece durează mai mult timp pentru finalizare, se spune că are un randament mai mare de celule viabile. Acest lucru se datorează faptului că deteriorarea celulelor este minimizată în tripsinizarea la rece, deoarece nu utilizează pași de centrifugare viguroase. Aceasta este diferența dintre tripsinizarea caldă și cea rece.
