Diferența cheie – PCR vs secvențierea ADN
PCR și secvențierea ADN sunt două tehnici importante în biologia moleculară. Reacția în lanț a polimerazei (PCR) este procesul care creează un număr mare de copii ale unui fragment de ADN. Secvențierea ADN-ului este tehnica care are ca rezultat ordinea precisă a nucleotidelor unui fragment de ADN dat. Aceasta este diferența cheie dintre PCR și secvențierea ADN. PCR este unul dintre etapele majore implicate în secvențierea ADN-ului.
Ce este PCR?
Reacția în lanț a polimerazei (PCR) este o tehnică de amplificare a ADN-ului utilizată în biologia moleculară. Produce mii până la milioane de copii ale unui anumit fragment de ADN. Această metodă a fost dezvoltată de Kary Mullis în 1983. În această tehnică, fragmentul de ADN care urmează să fie amplificat servește ca șablon, iar enzima ADN polimerază adaugă nucleotide complementare primerului care este disponibil în amestecul PCR. La sfârșitul reacției PCR, sunt sintetizate multe copii ale probei de ADN.
Există diferite componente ale amestecului PCR, inclusiv ADN, ADN polimeraza (Taq polimeraza), primeri (primeri directe și inverse), nucleotide (blocuri de construcție ale ADN-ului) și un tampon. PCR are loc în interiorul unei mașini PCR, iar amestecul PCR corect ar trebui să fie încărcat în mașină, iar programul corect ar trebui să fie condus. Această tehnică permite producerea a mii până la milioane de copii ale unei anumite secțiuni de ADN dintr-o cantitate foarte mică de ADN.
Reacțiile PCR apar într-o manieră ciclică pentru a produce cantitatea vizibilă de produse PCR pe un gel. Există trei etape majore implicate într-o reacție PCR și anume denaturarea, recoacere primerului și extensia catenei, așa cum se arată în Figura 01. Acești trei pași au loc la trei temperaturi diferite. ADN-ul există sub formă dublu catenară prin legături de hidrogen între bazele complementare. Înainte de implicare, ADN-ul dublu catenar trebuie separat unul de celăl alt. Se face dând o temperatură ridicată. La o temperatură ridicată, ADN-ul dublu catenar se denaturază în catene simple. Apoi primerii ar trebui să se apropie mai mult de capetele de flancare ale fragmentului specific sau ale genei ADN-ului. Primerul este o bucată scurtă de ADN monocatenar care este complementară secvenței țintă. Primerii direct și invers se recoacă cu bazele complementare la capetele de flancare ale probei de ADN denaturate la temperatura de recoacere. Grundurile trebuie să fie rezistente la căldură. Odată ce primerii se recoacă cu proba de ADN, enzima polimerază taq inițiază sinteza noilor catene prin adăugarea de nucleotide care sunt complementare ADN-ului țintă. Taq polimeraza este o enzimă stabilă la căldură izolată dintr-o bacterie termofilă numită Thermus aquaticus. Tamponul PCR menține condițiile optime pentru acțiunea polimerazei taq. Aceste trei etape ale reacțiilor PCR sunt repetate pentru a produce cantitatea necesară de produs PCR. După fiecare reacție PCR, numărul de copii ADN este dublat. Prin urmare, o amplificare exponențială poate fi observată în PCR. Produsele PCR pot fi observate folosind electroforeza pe gel și pot fi purificate pentru studii ulterioare.
Figura 01: Pașii majori ai unei reacții PCR
PCR este un instrument valoros în cercetarea medicală și biologică. PCR are o valoare deosebită în știința criminalistică, deoarece poate amplifica ADN-ul pentru studii din mostre minuscule de la criminali și poate face profile ADN criminalistice. PCR este utilizat pe scară largă în multe domenii ale biologiei moleculare, inclusiv genotiparea, clonarea genelor, detectarea mutațiilor, secvențierea ADN, micromatrice ADN și testarea paternității etc.
Figura 02: Reacția în lanț a polimerazei
Ce este secvențierea ADN?
Secvențierea ADN este determinarea unei ordini precise a nucleotidelor – adenina, guanina, citozină și timină dintr-un fragment de ADN dat. Informațiile genetice sunt stocate în secvențele de ADN folosind ordinea corectă a nucleotidelor. Prin urmare, găsirea ordinii precise a nucleotidelor dintr-un fragment de ADN este foarte important să cunoaștem structura și funcția genelor.
Protocolul de secvențiere ADN implică procese diferite. Primul pas este izolarea ADN-ului interesat sau ADN-ului genomic al unui organism. Folosind PCR (așa cum este descris mai sus), regiunea dorită a ADN-ului trebuie amplificată. Produsul PCR amplificat trebuie separat prin electroforeză pe gel și purificat. Fragmentele amplificate sunt servite ca șabloane pentru secvențiere. Secvențierea poate fi făcută fie urmând secvențierea Sanger, fie metoda de secvențiere cu randament ridicat. Secvențierea Sanger necesită electroforeza capilară a fragmentelor de ADN rezultate. Determinarea ordinii corecte a nucleotidelor se poate face prin citirea manuală a autoradiografiilor sau folosind secvențiere ADN automate.
Secvențierea genelor a contribuit la proiectul Genomului uman și a facilitat cartografierea genomului uman în 2003. În criminalistică, secvențierea ADN-ului a permis identificarea indivizilor care prezintă secvențe ADN unice și identifică criminalii. În medicină, secvențierea ADN-ului poate fi folosită pentru a detecta genele responsabile de boli genetice și de altă natură, pentru a găsi gene defecte și pentru a le înlocui cu gene corecte. În agricultură, informațiile de secvențiere a ADN-ului unor microorganisme sunt folosite pentru a produce culturi transgenice cu caracteristicile dorite din punct de vedere economic.
Figura 03: Secvențierea ADN
Care este diferența dintre PCR și secvențierea ADN?
PCR vs secvențierea ADN |
|
| Procesul PCR creează de la mii la milioane de copii ale fragmentului de ADN interesat. | Secvențierea ADN este procesul de determinare a ordinii precise a nucleotidelor dintr-un anumit fragment de ADN. |
| Rezultat | |
| PCR creează de la mii la milioane de copii ale unui anumit fragment de ADN | Acest lucru are ca rezultat ordinea corectă a bazelor dintr-un anumit fragment de ADN. |
| Implicarea ddNTPs | |
| PCR nu necesită ddNTP-uri. Utilizează dNTP-uri. | Secvențierea ADN necesită ddNTP pentru a opri formarea catenei. |
Rezumat – PCR vs secvențierea ADN
PCR și secvențierea ADN-ului sunt instrumente foarte importante în multe domenii ale biologiei moleculare. Amplificarea fragmentelor de ADN se face prin tehnica PCR în timp ce ordinea corectă a nucleotidelor unui fragment de ADN este determinată de secvențierea ADN-ului. Aceasta este diferența dintre PCR și secvențierea ADN.
