Diferența cheie – RAPD vs RFLP
Marcerii genetici sunt utilizați în biologia moleculară pentru a identifica variațiile genetice între indivizi și specii. Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) și Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) sunt doi markeri moleculari importanți utilizați în mod obișnuit în laboratoare. RAPD se realizează cu primeri oligonucleotidici scurti și arbitrari și se bazează pe amplificarea aleatorie a mai multor locații de-a lungul ADN-ului matriță al organismului. RFLP se realizează cu o endonuclează de restricție specifică și se bazează pe polimorfismul fragmentelor de restricție rezultate și pe hibridizare. Diferența cheie dintre RAPL și RFLP este că RAPD este un tip de tehnică PCR efectuată fără cunoștințele anterioare despre secvență, în timp ce RFLP nu este implicat în PCR și necesită cunoștințe anterioare despre secvență pentru a realiza tehnica.
Ce este RAPD?
RAPD este un marker molecular util în biologia moleculară. Este o tehnică rapidă și ușoară. RAPD poate fi definită ca o metodă care are ca rezultat secvențe de ADN polimorfe ca rezultat al amplificării aleatorii a mai multor locații ale matriței ADN țintă. RAPD utilizează primeri oligonucleotidici scurti cu secvențe arbitrare pentru amplificarea PCR. Primerii sunt sintetizați artificial fără cunoștințele anterioare ale secvenței. Prin urmare, este considerată o tehnică ușoară și utilă.
Următorii pași majori sunt implicați în RAPD.
- Extragerea ADN-ului țintă
- Amplificarea mai multor locații ale ADN-ului țintă folosind primeri aleși aleatoriu
- Electroforeza pe gel a produselor PCR amplificate
- Cotația cu bromură de etidio și identificarea polimorfismului
Ca rezultat al variației în recoacere a primerului, în timpul amplificării sunt generate fragmente diferite cu lungimi diferite. Prin urmare, modelele de benzi pe geluri sunt diferite între indivizi și specii. Astfel, RAPD permite detectarea variației genetice între organisme în identificarea și diferențierea.
RAPD este aplicat în diverse studii de biologie moleculară, cum ar fi identificarea diferenței genetice între specii strâns înrudite, cartografierea genelor, amprentarea ADN-ului, identificarea bolilor moștenite etc.
Figura 01: RAPD
Ce este RFLP?
Restriction Fragment Length Polymorphisms (RFLP) este un marker molecular utilizat în biologia moleculară pentru identificarea variației genetice în secvențele de ADN omoloage. Este primul marker genetic dezvoltat pentru amprentarea ADN-ului. Toate organismele produc profiluri ADN unice atunci când sunt restricționate cu enzime de restricție specifice. RFLP servește ca un instrument important în producerea de profiluri ADN unice ale indivizilor și detectarea variației genetice între aceștia. Când probele de ADN sunt digerate cu endonucleaze de restricție specifice, rezultă profiluri ADN diferite, care sunt unice pentru fiecare individ. Prin urmare, principalul acestei metode este detectarea variației genetice între organisme prin restrângerea ADN-ului omolog cu enzime de restricție specifice și analiza polimorfismului lungimii fragmentului prin electroforeză și blotting pe gel. Modelele de blotting sunt unice pentru fiecare organism și caracterizează genotipurile specifice.
Pașii următori sunt implicați în RFLP.
- Izolarea unei cantități suficiente de ADN din probe
- Fragmentarea probelor de ADN cu endonucleaze de restricție specifice în secvență scurtă
- Separarea fragmentelor rezultate cu lungimi diferite prin electroforeză pe gel de agaroză.
- Transferul profilului de gel într-o membrană prin Southern blot
- Hibridizarea membranei cu sonde marcate și analiza polimorfismului lungimii fragmentului în fiecare profil
RFLP are diverse aplicații, cum ar fi diagnosticarea bolilor moștenite, cartografierea genomului, identificarea criminală în studiile criminalistice, testarea paternității etc.
Figura 02: genotiparea RFLP
Care este diferența dintre RAPD și RFLP?
RAPD vs RFLP |
|
| RAPD este un marker molecular bazat pe primeri aleatoriu și PCR. | RFLP este un marker molecular bazat pe producerea de diferite fragmente de restricție de lungime. |
| Eșantion obligatorie | |
| Probele mici de ADN sunt suficiente pentru analiza RAPD. | O cantitate mare de probă de ADN extrasă este necesară pentru analiza RFLP. |
| Timp | |
| RAPD este un proces rapid. | RFLP este un proces care consumă mult timp. |
| Primer Utilizare | |
| Se folosesc primeri aleatoriu și aceiași primeri pot fi utilizați pentru diferite specii. | Sonde specifice speciei sunt folosite în RFLP pentru hibridizare. |
| Fiabilitate | |
| Fiabilitatea tehnicii este mai mică în comparație cu RFLP. | RFLP este o tehnică de încredere. |
| Blotting | |
| RAPD implică Southern blot. | Southern blotting este un singur pas al RFLP. |
| Detecția variației alelice | |
| Variațiile alelice nu pot fi detectate de RAPD. | Variațiile alelice pot fi detectate prin RFLP. |
| Nevoia de cunoaștere a secvenței | |
| RAPD nu necesită cunoștințe anterioare de secvență. | Pentru proiectarea sondei sunt necesare cunoștințe anterioare de secvență. |
| PCR | |
| PCR este implicat în RAPD | PCR nu este implicat în RFLP. |
| Reproductibilitate | |
| RAPD are o reproductibilitate scăzută | RFLP are o reproductibilitate ridicată în comparație cu RAPD. |
Rezumat – RAPD vs RFLP
RAPD și RFLP sunt markeri importanți utilizați în biologia moleculară. Ambele metode sunt capabile să detecteze variația genetică între organisme. RAPD se realizează folosind primeri aleatori. RFLP se efectuează folosind enzime de restricție specifice. Ambele metode produc profile ADN unice pentru organismele individuale. RAPD este implicat în comparație cu puțini pași decât RFLP. Dar produce rezultate mai puțin fiabile și reproductibile decât RFLP. Aceasta este diferența principală dintre RAPD și RFLP.
