Diferența cheie – SYBR Green vs Taqman
SYBR Green și Taqman sunt două metode folosite pentru a detecta sau urmări procesul de amplificare a PCR în timp real. SYBR Green este o metodă bazată pe intercalarea coloranților cu acid nucleic, în timp ce Taqman este o metodă bazată pe sonde de hidroliză. Ambele tehnologii sunt concepute pentru a genera fluorescență în timpul PCR, ceea ce permite mașinii PCR în timp real să monitorizeze reacția în „timp real”. Metoda SYBR Green este realizată folosind un colorant fluorescent numit SYBR green și detectează amplificarea prin legarea colorantului de ADN-ul dublu catenar produs. Taqman se efectuează folosind sonde cu etichetă dublă și detectează amplificarea prin degradarea sondei de către polimeraza Taq și eliberările de fluorofor. Aceasta este diferența cheie dintre SYBR Green și Taqman.
Ce este SYBR Green?
SYBR Green este un colorant fluorescent folosit pentru colorarea acizilor nucleici, în special ADN-ul dublu catenar în biologie moleculară. Metoda SYBR Green este utilizată pentru a cuantifica produsele PCR în timpul PCR în timp real. Odată ce se leagă de ADN, complexul ADN-colorant rezultat absoarbe lumina albastră și emite lumină verde intensă. Se întâmplă din cauza schimbării structurale care are loc în molecula de colorant la legarea cu ADN-ul dublu catenar. Când PCR creează din ce în ce mai mult ADN, mai multe molecule de colorant se leagă de ADN, generând mai multă fluorescență. Prin urmare, fluorescența crește odată cu acumularea produsului PCR. Prin urmare, cantitatea de produs PCR poate fi măsurată cantitativ prin detectarea fluorescenței SYBR Green.
Colorantul verde SYBR poate fi folosit și pentru marcarea ADN-ului în citometrie și microscopie fluorescentă. Bromura de etidio a fost înlocuită cu succes de SYBR Green, deoarece bromura de etidio este un colorant cancerigen cu probleme de eliminare în timpul vizualizării ADN-ului în electroforeza pe gel.
Există avantaje și dezavantaje ale metodei verde SYBR. Această metodă este foarte sensibilă, ieftină și ușor de utilizat. Cu toate acestea, datorită capacității sale de a se lega de orice ADN dublu catenar, legarea nespecifică poate duce la supracuantificarea produsului PCR.
Figura 01: Tehnica verde SYBR
Ce este Taqman?
Taqman este o metodă alternativă la SYBR Green pentru a monitoriza procesul PCR în timp real. Această metodă depinde de activitatea exonucleazei 5’ – 3’ a enzimei polimerazei Taq pentru a degrada sondele în timpul extinderii noii catene și eliberării fluoroforului. În această metodă sunt utilizate sonde cu etichetă dublă și se bazează pe hidroliza sondelor. Sondele sunt oligonucleotide ADN marcate fluorescent având o moleculă reporter fluorescent (fluorofor) la capătul 5’ și o moleculă de stingere la capătul 3’. Ele sunt proiectate pentru a se lega de șablonul monocatenar de pe partea opusă recoacerilor de amorsare. Taq polimeraza adaugă nucleotide la primer și extinde noua catenă către sondele marcate dublu. Odată ce polimeraza Taq întâlnește sonda, acțiunea exonuclează a polimerazei Taq activează și degradează sonda. Odată ce termină sinteza noii catene, sonda este supusă unei degradări complete și eliberează fluoroforul. Eliberarea de fluorofor generează fluorescență. Molecula de stingere fluorescentă stinge în mod eficient lumina emisă și creează ieșirea pentru cuantificarea produsului PCR. Eliberarea de fluorofori și cantitatea de produse PCR sunt proporționale. Prin urmare, cuantificarea poate fi făcută cu ușurință prin metoda Taqman.
Figura 02: Metoda Taqman
Metoda Taqman este utilizată în PCR în timp real, cuantificarea expresiei genelor, detectarea polimorfismelor genetice, cuantificarea delețiilor ADN cromozomial, identificarea bacteriilor, verificarea analizei microarray, genotiparea SNP etc.
Care este diferența dintre SYBR green și Taqman?
SYBR Green vs Taqman |
|
| SYBR Green se bazează pe colorant de legare la ADN. | Taqman depinde de sondele de hibridizare și de activitatea exonucleazei 5’ până la 3’ a polimerazei Taq. |
| sonde etichetate fluorescent | |
| Nu sunt necesare sonde marcate fluorescent. | Sunt necesare sonde cu dublă etichetă. |
| Analiza genetică multiplex | |
| Nu poate fi utilizat pentru ținte de gene multiplex. | Poate fi folosit pentru ținte genetice multiplex. |
| Cost | |
| Acest lucru este mai puțin costisitor. | Acesta este mai scump. |
| specificitate | |
| Acest lucru este mai puțin specific și se leagă de orice ADN dublu catenar | Acestea sunt foarte specifice, deoarece sondele detectează produsele specifice de amplificare. |
| Eficacitate | |
| Acest lucru este mai puțin eficient. | Acest lucru este foarte eficient. |
| Aplicație | |
| Acest lucru este utilizat în PCR în timp real, vizualizarea gelului de agaroză, etichetarea ADN-ului etc. | Acest lucru este utilizat în PCR în timp real, cuantificarea expresiei genelor, detectarea polimorfismelor genetice etc. |
Rezumat – SYBR Green și Taqman
Taqman și SYBR green sunt două metode folosite în PCR în timp real (PCR cantitativ). Ambele metode permit cuantificarea eficientă a produsului PCR și se bazează pe emisia de fluorescență. Metoda Taqman folosește sonde cu două etichete pentru detectarea ADN-ului acumulat, în timp ce metoda SYBR Green folosește un colorant fluorescent. Ambele metode au, de asemenea, aplicații diferite în biologia moleculară.
